猴的金属硫蛋白β-结构域的改造及其结构与性质关系的研讨.pdfVIP

中文摘要 f在哺乳动物金属硫蛋白的6l或62个氨基酸残基中，有20个十分保守的半 胱氢酸。它们通常结合7个二价后过渡金属离子。结合7个二价后过渡金属离子 端的d．domain(M(“)4．CysII)。通过大量哺乳动物金属硫蛋白一级序列的比较， 口一domain的两端。因此，我们认为Ⅱ一domain中四金属硫簇的形成，不仅与 n．domain中半胱氨酸残基的数目有关，而且可能与半胱氨酸残基的特定分布有 关。为了研究半胱氨酸残基及其在肽段上的分布方式对金属硫蛋白及其金属硫簇 在结构域形成和蛋白整体反应活性中所起的作用，本论文使用分子生物学定点突 变的方法， 设计和突变了野生型猴金属硫蛋白MTl，获得了N4C．T27C和 片段。通过使用谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白表达系统，获得了含有猴金属硫蛋白 MTI肽段的融合蛋白。经过凝血酶酶切及Cd2+离子重组，以较高的产率得到 了重组野生型及突变体猴金属硫蛋白MTl。野生型蛋白的产率为10mg／L培养 液，各突变体蛋白均大于8mg几培养液。杖 瓜通过考察猴金属硫蛋白及其N4C，T27C和N4C／T27C突变体蛋白的紫外 光谱和园二色相光谱性质，发现增加的Cys4和Cys27确实参与了金属硫簇的 形成。在结构整体上，突变体蛋白a-domain的结构未受B片段中增加半胱氨 酸残基数目的影响。f电喷雾质谱研究表明，将Thr27突变为Cys27并末导致四 5-dithiobis(2-nitrobenzoicacid))反应活性及热变性的研究，可以认为通过定点突 变所得到的在D-domain中增加了半胱氨酸残基的三种新的金属硫蛋白MTI突 变体，仍然形成了被肽段包裹的金属硫簇。这些新的金属硫簇被肽段以比野生型 B-domain紧密的方式包裹。新的金属硫簇的生成在一定程度上消除了0．和 Ⅸ一domain在酸稳定性和巯基反应活性上的差别。但由于突变影响了结构域间的 相互作用，以及其他氨基酸残基可能的影响，突变体蛋白的热稳定性不如野生型 蛋白。心 ／ 此外，拉曼光谱的测量也说明在猴金属硫蛋白及其N4C，T27C和 N4C／T27C荑菱丽中，不存在a_heli—x 13-sheet结构。所得到的含镉蛋白 中，也不存在游离巯基和二硫键。本论文还对金属硫蛋白的电化学测量进行了尝 试。 最后，本论文认为，经N4C、N4C／T27C突变，野生型猴金属硫蛋白中的天 簇的堕塑垫该结构域的形成，一定程度上消除了原来p-和o【一domain在反应 活性上的差别。这支持了我们关于金属硫蛋白结构域中四金属硫簇的形成，不仅 与肽段上半胱氨酸残基的数量有关，还与半胱氨酸残基在肽段上的分布位置有关 的观点。 Abstract of a metalloproteins Mammalianmetallothioneins(MTs)arehomologousfamily acid chainof61or62amino them， a residues．Among consistingsinglepolypeptide 20 conservedresiduesbindsevenbivalent metalions· strictly cysteine post-transition twodomains．Inthe metallothioneinis foldedinto ofmammalian Polypeptide N．terminalisa of intheC-t