橘核柠檬苦素类化合物生物合成功能基因的克隆 表达及成分积累研究-cloning, expression and component accumulation of functional genes of citrus limonoids biosynthesis.docxVIP

成都中医药大学 成都中医药大学 2015 届硕士学位论文 万方数据 万方数据 中文摘要 橘核的主要药理活性成分为柠檬苦素类化合物。课题从柠檬苦素类化合物生 物合成路径的中、下游阶段选择了三个功能基因开展深入研究——克隆、分析、 表达了角鲨烯合成酶基因、角鲨烯环氧酶基因、柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因， 分析了柠檬苦素类化合物成分在茎（韧皮部）、叶片、果皮、种子（胚）等器官 的积累规律，为柠檬苦素类化合物生物合成机制和转运规律的研究奠定了基础。 1.样本总 RNA 提取、功能基因克隆和生物信息学分析 采用 Omega 试剂盒用于样本总 RNA 提取并进行凝胶电泳检测，对纯度符合 要求的 RNA 逆转录。根据同源基因参考序列设计特异性引物，考察 PCR 条件， 得到 PCR 产物，并对 PCR 产物进行测序，从大红袍 Citrus reticulata‘Dahongpao’ 成熟种子（胚）中成功克隆获得了 ss、se、lgt 基因序列。 对关键功能基因序列进行比对和进化分析，并对其所编码的蛋白质进行序列 比对，一级、二级、三级结构预测，开放阅读框识别、疏水性图谱预测，信号肽 切割位点，对柠檬苦素类化合物生物合成路径中功能基因和关键酶进行进一步的 了解和分析，清楚其结构和特点。 2.柠檬苦素类化合物生物合成过程中功能基因的表达 建立了大红袍样本的 real-time PCR 表达方法，得到了 ss、se、lgt 三个基因 在茎（韧皮部）、叶、果皮、种子（胚）四个不同器官的基因相对表达量。 三个基因在种子（胚）中的主要表达趋势为 ss＞se＞lgt；三个基因在同一器 官中的表达变化趋势基本相同；四个不同器官中主要基因表达变化时期为种子成 熟期，种子形态建成末期和脱水期基因表达变化程度较小。 繁殖器官种子（胚）和果皮中基因表达情况基本相似，均为成熟期三个基因 表达先上升后下降，存在一个最高表达时期，形态建成末期和脱水期三个基因表 达量较低；而营养器官茎（韧皮部）和叶片中基因表达情况基本类似，均为形态 建成末期三个基因表达先下降，再上升至最高值，存在一个高表达阶段，成熟期 三个基因表达上升、下降再上升至次高值，脱水期三个基因的表达较低。 3.有效成分在各器官积累规律研究 采用 UPLC 法对不同时期所收集样本中的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮进行了 I 含量测定，对其积累和转运规律进行了初步研究。 柠檬苦素类成分在种子（胚）中分三个阶段逐渐积累，形态建成末期先下降 再上升至第一个次高值，成熟期先上升至第二个次高值后下降，脱水期快速积累 达到最高值。柠檬苦素类化合物在种子（胚）中的含量较高，其含量在干燥期达 到最高，推测种子（胚）可能是柠檬苦素类化合物的最终储存位置，果实完全成 熟（12 月中旬）前后为橘核药材的最佳采收期之后有效成分含量急剧下降。 三个成分在四个不同器官中变化趋势基本一致，且大小次序均为柠檬苦素＞ 诺米林＞黄柏酮。在 130 天果实和种子发育成熟阶段，繁殖器官（种子）中有效 成分总含量为升高趋势，营养器官（茎、叶片）中有效成分总含量变化不明显。 推测有效成分可能是通过营养器官不断向繁殖器官转运，并在繁殖器官中积累。 4.基因表达量与成分积累的灰色关联度分析 采用 DPS 软件对基因表达量和有效成分之间的关联性进行分析，种子（胚） 中柠檬苦素、诺米林、黄柏酮各个有效成分含量积累贡献最大的均为 lgt基因， 其次为 ss和 se基因。lgt主要是在柠檬苦素类化合物生物合成的下游阶段，催 化柠檬苦素类化合物转化为相应的葡萄糖苷过程中发挥作用。 茎（韧皮部）、叶片中柠檬苦素、诺米林、黄柏酮各个有效成分含量积累贡 献值最大的均为 ss基因，其次为 se和 lgt基因。ss和 se主要在柠檬苦素类化 合物生物合成中游阶段即角鲨烯合成诺米林过程中发挥作用，在茎的韧皮部合成 其前体诺米林，然后进行转运和转化过程。 茎和叶片两个营养器官有效成分总含量受基因的影响程度相同；橘核作为柠 檬苦素类化合物的主要贮存部位，其化学成分受基因影响程度与其他部位相比存 在较大差异。 关键词：橘核；柠檬苦素类化合物；功能基因；克隆；表达；关联性分析 II Abstract Limonoids is the major pharmacologically active ingredient compound in Juhe. Topics selected three genes from the downstream stages limonoids compound biosynthetic pathway for depth research － cloning, analysis, expression of ss, se, lgt.analyzed li