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一氧化氮对桦褐孔菌多酚类化合物抗氧化的影响 摘要：本研究的目的是评价一氧化氮（ NO ）对桦褐孔菌深层发酵产物酚类化合物及其抗氧化活性的影响。 NO以硝普钠（SNP）的形式添加到发酵液中，其终浓度分别为0.01mmol / L， 0.1mmol / L和1mmol / L。抗氧化活性在清除DPPH 和羟自由基等方面有了明显的体现。当硝普钠的终浓度为0.1mmol / L时，桦褐孔菌的胞内和胞外酚类化合物的量达到最高，其水平分别达到67.00mg / L和677.00mg / L。过度地向桦褐孔菌中添加硝普钠（ 1mmol / L ）会导致酚类化合物和菌丝生物量的减少。添加了0.1mmol / L硝普钠的培养液在不同培养时间段产生的胞内和胞外酚类化合物，都具有最有效的猝灭自由基的抗氧化活性。因此一氧化氮可作为上调桦褐孔菌深层发酵产物酚类化合物积累的因素之一。 关键词：一氧化氮( NO)，硝普钠(SNP)，桦褐孔菌，酚类化合物，抗氧化活性 导言 桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属担子菌亚门、层菌纲, 非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。分布于北美、芬兰、波兰、俄罗斯及我国黑龙江、吉林等地区, 寄生于桦树、榆树、赤杨等的树皮下或活立木的树皮下或砍代后树木的枯干上[1]。该菌在俄罗斯已有一百多年的应用历史, 是具有显著的药理活性而对人体没有任何副作用的一种药用真菌[2]。研究表明：酚类化合物是桦褐孔菌主要活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤[3] 、抗病毒、增强机体免疫[4]、益肝护肾、抑菌、抗艾滋病 [5]等作用。因此, 桦褐孔菌具有重大的药学价值。然而, 桦褐孔菌在野生环境下生长极为缓慢, 远远满足不了日益增长的市场需求。为此, 有很多学者开始尝试人工固体栽培研究。然而, 大量实践证明, 固体栽培生长周期长, 极易被杂菌污染, 并且受场地和季节的限制[6]，目前国内外尚无培养成功的先例。而深层发酵培养则生长周期短, 产量高, 不受场地和季节的限制, 是解决桦褐孔菌资源危机的重要途径。但是由于实验室培养环境和野生环境存在巨大的差异，桦褐孔菌的深层培养出现了与高等植物细胞悬浮培养相似的情况，即次生代谢产物包括多酚类化合物含量很低。 在努力改变桦褐孔菌酚类化合物代谢期间，我们发现，添加硝普钠（ NO供??）激发了桦褐孔菌酚类化合物积累的显著增加。这激起了我们关于一氧化氮在桦褐孔菌合成酚类化合物方面可能产生的影响的调查。在这项研究中，我们对一氧化氮在酚类化合物的积累及其抗氧化活性方面进行了测定。 1材料与方法 1.1菌种，接种制备和培养条件 桦褐孔菌采自牡丹江镜泊湖火山口, 标本由俄罗斯真菌学家M argarita A B 教授鉴定保存于江苏省药用植物生物技术重点实验室（编号：LBMP2004005）。菌种经PDA 斜面纯化培养后接入液体培养基,在26℃、140r/min 的黑暗条件下振荡培养10 d 形成一级种子, 分别接入装有200mL 基本培养基三角烧瓶中, 接种量为5% , 培养条件同上。基本培养基为葡萄糖2%, 蛋白胨0.35%, 酵母膏0.1%, 磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸镁0.05%, 氯化钙0.01%, pH 在自然条件下。并在摇床中培养（26 ℃ ， 140r/min）13天。在第三天在摇瓶中加入硝普钠并使其终浓度分别为0.01 ， 0.1 ， 1mmol / L。培养基中没有加入硝普钠的作为对照。所有培养液一式三份，隔天取样（ 20mL ），然后进行分析和处理。 1.2分析方法 菌丝体生物量估计为详细早些时候（Zheng et al 2008） 。对于胞内酚类化合物的分析（TIP） ，菌丝球被无菌过滤回收，用无离子水洗涤3次，然后加入10倍体积 80 ％的乙醇在冰浴中超声提取（JY92-IIN, Scientz, China）30分钟（超声间隔9秒）。等分试样（ 1mL ）的匀浆被用来确定菌丝生物量，其余的离心10分钟（10,000×g，4 ℃）。将含有总酚类化合物（TIP）的上清液在真空条件下浓缩并在氮气氛围中蒸发至干燥，然后在-20 ℃储存至检测。总胞外酚类化合物的准备（TEP） ，将无菌丝体的培养液真空浓缩并加入3倍体积的乙醇沉淀可能存在的胞外多糖，再用乙酸乙酯提取。该提取物在氮气下蒸发至干燥，并储存在-20 ℃至检测。用Folin-Ciocalteu方法（Singleton and Rossi 1965）测定总酚含量，先使用0 - 80mg / L的没食子酸制作标准曲线（Sigma, USA），再用等量的没食子酸表示总酚含量（GAE）。 根据（Zheng et al 2009）所述的程序通过清除DPPH自由基和