双重识别基团蛋白质印迹树脂的制备和自然蛋白质酶活性的测定.pdfVIP

摘要 摘要 本文内容分为两部分：第一部分研究了用蛋白质印迹技术提取天然微量蛋 白；第二部分对提取的天然猪亲环素18蛋白质进行肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase) 活性测定，并检测了其对环孢菌霉素A(CsA)免疫抑制剂的灵敏性。 本文第一部分研究工作是在本实验室蛋白质印迹技术研究成果的基础上对 蛋白质印迹树脂的进一步改进。近年来，许多研究者开展了以蛋白质为模板的 分子印迹聚合物的研究，并希望能够以此作为分离纯化蛋白质的一种手段。但 是，在高等生命体中绝大多数蛋白质在细胞中的含量是非常微小的，一般只占 细胞液中总蛋白量的万分之几或者更少，所以难以找到模板蛋白质。随着分子 克隆技术的建立和发展，使得人们可以用分子克隆的手段在大肠杆菌和酵母等 低等生命体中表达高等生命体中的微量蛋白质，通过低等生物的大量培养繁衍， 得到很大的收获量。然而尽管克隆蛋白质和天然蛋白质十分接近，但仍不是相 同的。结构上的差异会带来很大的功能上的差异，因此纯化天然微量蛋白质一 直是科学家们研究的热点。在以前的研究工作中，我们在识别体系中引入了限 长的辅助识别聚合物链，发现羧基酸性基团和吡啶芳香环基团对蛋白质均有特 殊的作用，提高了对目标蛋白识别的专一性，取得了很好的富集效果。 本课题制备了一种带有双重识别基团的蛋白质印迹树脂，我们在识别体系 中引入了随机分布有羧基和吡啶基团的辅助识别聚合物链，以在大肠杆菌中大 量表达的克隆猪亲坏素18蛋白质为模板，以80一100目的聚乙烯醇接枝微球树 脂为印迹载体，从细胞提取液中吸附天然目标蛋白。富集倍数达到210倍，使 天然目标蛋白的浓度由0．08％提高到16．5％，且蛋白质印迹树脂的吸附量达到 1．2pg／g，足以用来测定天然蛋白质的酶活性。 本文第二部分工作是对天然猪亲环素18蛋白质进行PPIase酶活性测定。多 肽链中肽酰．脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象差别明显。肽酰一 脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。肽酰．脯氨酰顺反异 构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多 肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。并且亲免蛋白的PPIase活性受到外源配体 的强烈抑制。 摘要 本课题发现天然猪亲环素18亲免蛋白的PPIase活性要比克隆蛋白质高， 而且对外源配体环孢菌霉素A(CsA)的PPlase抑制也有更高的敏感性。 关键词：蛋白质印迹树脂辅助识别聚合物链克隆蛋白质模板PPIase活性 II Abstract first the oftwo investigates is part Tllisdissertation parts：the composed lowcontent second activenatural protein·The enriching technique protein．imprinting Ollthe ofnatural18peptidyl-prolyl dissertationfocuses assay pCyP ofthis part A andthe to