功能性聚合物的定点联合对蛋白质生物活性的调控.pdf

功能性聚合物的定点结合对蛋白质生物活性的调控 中文摘要 功能性聚合物的定点结合对蛋白质生物活性的调控 中文摘要 蛋白质生物活性的调控在人类健康和疾病治疗中具有重要的意义。如何精确地控 制蛋白质的结构和活性等生物学性能是解决其在疾病治疗、分子诊断和组织工程等生 物医学领域中应用问题的关键。利用聚合物对蛋白质进行改性从而提高蛋白质性能的 研究受到越来越广泛的关注。聚合物与蛋白质表面的定点结合可以得到结构可控的蛋 白质-聚合物偶联物，其中聚合物的性质以及在蛋白质表面的引入位点是关系其最终 应用性能的重要因素。 本论文的主要工作是制备多种功能性聚合物定点改性的蛋白质，系统研究聚合物 的种类及其与蛋白质的结合位点对蛋白质生物学性能的影响。具体研究内容如下： 首先，制备了一系列不同位点处含有巯基的模型蛋白质。通过基因重组的方法获 得了野生型无机焦磷酸酶 （PPase ），通过基因定点突变的方法在PPase 表面特定位点 处引入半胱氨酸残基，制备了一系列在不同位点处含有巯基的突变型PPase ，并最终 作为聚合物定点结合的蛋白质模型。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）表 征表达纯化的PPase 及其突变体的纯度，通过测定PPase 催化焦磷酸钠水解生成正磷 酸盐的含量表征PPase 及其突变体的活性，通过Ellman 法测定PPase 及其突变体的 自由巯基含量。结果表明：通过突变基因的构建以及突变体蛋白质的表达纯化我们获 得了纯度极高的突变体蛋白质，并成功在蛋白质表面的不同位点处引入一个可自由反 应的巯基，突变型PPase 的活性与突变位点的位置和氨基酸残基种类有关，但总体来 说，虽然活性有一定的变化，但这种变化并不会对其后续的研究产生重要的影响，因 此获得的突变体蛋白质可以用于下一步研究。 然后，制备了生物相容性聚合物聚甲基丙烯酸羟乙酯（pHEMA ）与 PPase 的偶 联物，研究了pHEMA 的引入对蛋白质活性和构象的影响，并与小分子巯基修饰试剂 对氯汞苯甲酸 （PCMB ）对蛋白质的影响进行了比较。利用吡啶二硫基功能化的原子 转移自由基聚合 （ATRP ）引发剂引发ATRP 聚合制备末端基团功能化的pHEMA ；通 1 过核磁共振氢谱（HNMR ）和凝胶渗透色谱（GPC ）对聚合物的分子量以及分子量分 布进行表征；通过吡啶二硫基功能化pHEMA 与靠近活性中心特定位点处含有巯基的 突变型PPase（PPaseK148C ）之间的化学结合将pHEMA 偶联到PPase 活性中心附近； 通过SDS和动态光散射 （DLS ）表征PPase-pHEMA 偶联物的形成；通过活性 I 中文摘要 功能性聚合物的定点结合对蛋白质生物活性的调控 测定研究PCMB 和pHEMA 的引入对PPase 活性的影响；通过还原剂的还原处理研 究pHEMA 和PCMB 对 PPase 活性的可逆调控；通过圆二色谱 （CD ）对 PCMB 和 pHEMA 偶联前后PPase 的构象变化进行表征。结果表明：PCMB 和pHEMA 在PPase 表面的引入可以抑制蛋白质的活性，而 pHEMA 的引入对蛋白质活性的抑制程度更 大。这种抑制作用可以通过不同还原剂的处理而得以消除。并且，这种 PCMB 和 pHEMA 偶联对PPase 活性的抑制以及还原剂处理对活性的恢复具有明显的可逆性。 PCMB 和pHEMA 对蛋白质活性的影响是由于其造成了蛋白质三级结构的变化。与小 分子PCMB 相比，聚合物pHEMA 的结合对蛋白质三级结构的改变更大。还原剂对 PPC-PCMB 和PPC-pHEMA 偶联物活性的恢复是由于其引起PCMB 和pHEMA 从蛋 白质表面的解离，从而使得蛋白质的构象得以恢复。这一蛋白质活性调节的策略有望 应用于生物检测、药物释放以及细胞功能调节等领域。 其次，制备了pH 响应性聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯 （pDMAEMA ） 与PPase 的偶联物，并研究了pDMAEMA 在蛋白质表面不同位点处的引入对蛋白质 活性和pH 稳定性的影