真核细胞RNA的制备与逆转录PCR-毛宇彬.pptVIP

实验五 真核细胞RNA的制备和ＲＴ－ＰＣＲ Trizol 法提取组织或培养细胞总RNA 实验背景知识 哺乳动物中，平均每个细胞大约含有10-5ugRNA。 RNA的分子组成： rRNA（占RNA总量的80%～85%），由28S、18S、5.85S及5S几类组成，它们之间同源性大、分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子交换层析进行分离。 tRNA和核内小分子RNA（占10%～15%） mRNA（占1%～5%）。 mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，因而是分子生物学中重要的研究对象。 mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，细胞中含量少，3’端存在20～230个多聚腺苷酸poly(A)。利用此特征，可很方便地从总RNA中，用寡聚（dT）亲和层析柱分离mRNA。 一、实验目的和原理 逆转录PCR（RT-PCR）是一种检测细胞及组织中特异性基因mRNA表达的实验室技术。 在中心法则中，可以以mRNA为模板在逆转录酶的催化下合成cDNA。所获得的cDNA反映了结构基因的组成，可用于构建cDNA文库并进行基因的表达调控等研究。 掌握真核细胞RNA提取方法 掌握逆转录聚合酶链反应的基本原理、实验基本条件 ; 熟悉PCR反应条件的优化和注意事项，PCR引物设计的基本原则，定量PCR的原理和用途。 RT-PCR扩增目的基因原理 首先，以细胞或组织中分离的总RNA中的mRNA为模板，加入特异性3’引物或多聚T锚定引物或随机引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA链；然后，以cDNA链为模板，由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。扩增特异的基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，以代表该基因的mRNA水平表达情况。 真核细胞RNA提取方法 RNA是一种极易降解的核酸分子，存在于细胞质和胞核中。 Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，使RNA从细胞中释放出来，同时亦使RNA分子从核糖体蛋白中解离下来，并抑制细胞释放出的核酸酶。十二烷基肌氨酸钠是一种离子型去污剂，能解离RNA上的核蛋白和抑制RNA酶活性，不容易析出沉淀。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA、核DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其它细胞组分分离出来，得到纯化的总RNA。 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。具有简便、经济和高效的优点。Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆等。 分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。的成败很大程度上决定于RNA的质量。 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，RNA酶很稳定，一般而言反应不需辅助因子，RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，它耐热、耐酸、耐碱，蛋白质变性剂可使之暂时失活。RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起严重的后果。 RNA分离的最关键因素是尽量避免RNA酶的污染。 实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品都需特别处理。一方面避免外源RNase的污染。要做到如下几点：①操作戴口罩和手套；②实验室保持洁净；③玻璃器皿须用0.1%二乙基焦碳酸盐（DEPC）浸泡处理，并高压灭菌，250℃烘干4小时以上（高压不能完全灭活RNase）；④所有溶液（除Tris外）须经DEPC浸泡处理；⑤实验中所有塑料器材最好灭菌后一次性使用，所有化学试剂用新包装。另一方面排除内源RNase污染。内源RNase是由组织细胞中携带，细胞破碎后即释放出来。因而力争在提取的起始阶段对RNase活力进行有效抑制，主要方法是使用RNase抑制剂，常用的有盐酸胍、异硫氰酸胍、RNase阻抑蛋白（RNasin）和氧钒核糖核苷复合物等。 所有分离提取RNA的方案的第一步操作都是在能导致RNA酶变性的化学环境中裂解细胞，然后才将RNA从各种生物大分子中分离出来。决定采用何种合适的制备方法，取决于RNA的细胞来源及其最终用途。本实验介绍从真核细胞中提取总RNA的通用方法，细胞用异硫氰酸胍裂解，此过程操作较少，从许多来源都能获得纯净的RNA，是从高内源性RNA酶的组织中提取RNA的首选方法。 PCR技术的产生和发展: .1971年Khorana于最早提出核酸体外扩增的设想 .1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明PCR技术 .1988年Saik