基因扩增技术PPT.pptVIP

7、对很难扩增的片段可考虑用下游引物反转录。 8、对长片段的策略。 RT-PCR实验的策略 PCR污染的对策 1、隔离不同的实验操作区，将提取RNA操作区、引物 分装区、PCR操作区及PCR产物分析区分开； 2、分装试剂，把试剂分装成小份，在冰箱中保存。目的 是为了减少重复取样所造成的污染； 3、改进实验操作，实验时戴一次性手套，加样中要避免反应液的飞溅。在操作多份样品时，要制备标准混合液，将各组分混匀后再分到不同的管，这样可以减少 操作污染，并且提高微量加样的精确度。 PCR污染的对策 4、设置对照 阳性对照：用已知的阳性模板； 阴性对照：加无关的或不加模板DNA; 重复实验：为防止因各种原因引起的实验 误差，应进行反复验证，以确 保实验结果的重演性。 污染的处理 酸处理：用1M的稀盐酸擦拭或浸泡污染器 件，可促进DNA脱嘌呤； 紫外灯照射：UV波长一般选择254/300 nm，照射30分钟即可。紫外照射可促使DNA形成二聚体，阻止链的延伸。紫外照射对长片段 的DNA有效，对短片段效果不大。 巢式PCR(nested PCR) 对于极微量的靶序列，一次扩增很难取得满意的效果，则可用巢式PCR进行多次扩增。引物之间的关系如下图所示： 引物1和引物4进行第一次扩增，其产物作为模板，用引物2和3作为再次PCR的引物。如果一次PCR产物在凝胶上有可见的条带，二次PCR只能用第一次PCR产物的1/104-105为模板。 Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应（PCR） Polymerase chain reaction又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，在模板DNA，引物（模板两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。 PCR的定义 PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，能检测每10万个细胞中仅含一个靶DNA分子的样品。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。 1993年获诺贝尔化学奖 PCR的种类 RT-PCR 反向PCR 不对称PCR 多重PCR 巢式RT-PCR 实时定量荧光PCR PCR温度循环参数 变性(denature)温度和时间 模板DNA的变性：模板DNA双链在93-96加热2’-10’解离；经 PCR扩增形成的双链DNA在93-96°C 加热30”-1’。 退火(anneal)温度和时间: Tm-5°C 温度降至55C左右，特异引物与模板DNA单链配对结合。 延伸(extend)温度和时间： 72°C 1000碱基/分钟 在TagDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模 板，引物为起始点，按碱基配对原理合成一条新的复制链。 循环数 在25~30个循环内，扩增的DNA量增加明显，然后进入平台期。 靶序列的初始浓度越低，所需循环数越高。 PCR扩增效率（实际） 实际上，PCR扩增效率比理论值要低。对于不同的基因来 说，扩增效率也大不相同。 (如图所示) 经过一定循环数之后，PCR产物的量增长缓慢，进入所谓的“平台期”，在PCR扩增反应达到平台期前，模板扩增产物(N) 与启始模板(N0) 之间呈下列方程所示关系: N = N0 ? (1+E) n 其中E是扩增效率， n是循环数。 演示PCR反应的过程！ PCR反应体系组成 （1） DNA模板 （2） 引物 （3） dNTP （4） 耐热的DNA聚合酶 （5） 10×PCR缓冲液(含Mg++) 模板核酸 PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。 RNA的扩增必须经逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环，称为RT-PCR。 PCR反应中模板加入量一般为102-105个拷贝的靶序列。 人工合成的寡核苷酸-引物 PCR扩增产物的特异性和扩增片段的大小是由引物限定的，因此，引物的设计对PCR的成功与否有决定性的意义。 引物设计原则：软件+经验 引物长度以15-30个碱基为宜； 引物碱基尽可能随机分布，G+C含量宜在45~55%左右； 引物内部不应形成二级结构； 两个引物之间不应形成二级结构； 引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性； 两个引物的Tm值要尽可能接近。 一般PCR反应中引物的终浓度为0.1-1?mol/L，在此范围内产物量基本相同。引物浓度低于0.1?mol/L时，产物量降低；引物浓度过高会引导非特异产物扩