实验11 生物显微制片技术PPT.ppt

实验九 生物显微制片技术;实验目的与要求;生物制片技术概述;切片法：石蜡切片法；火棉胶切片法；冰冻切片法等。 非切片法：包括整体封藏法；涂布法；压片法，此外还有铺片、磨片等。 显微制片需经历一系列操作，相当细致而复杂，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，手脑并用。;切片法与非切片法比较;1.3 压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖压片观察染色体。 1.4 磨片 用于质地坚硬的组织，如骨和牙。 1.5 离析法 此法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使组织分散成单个游离细胞。如植物去壁低渗法制备染色体标本。;2 切片法;2.1 石蜡切片法;详细步骤和各个环节要求;洗涤与脱水： 洗涤：固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多以流水冲洗。 脱水：洗涤后的组织内充满水分，需除去水分方可进行之后的透明、浸蜡与包埋。脱水用一种既能与水又能与透明剂混溶的液体来逐渐置换样品中游离的水。脱水剂常采用乙醇或丙酮、正丁醇、叔丁醇进行梯度脱水。每次时间为1～数小时。 脱水的过程：通常从30％或50％乙醇开始，一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100% 脱水剂浓度不应跨度太大，以免引起组织强烈的收缩或变形。; 透明 透明是用一种既能与脱水剂（乙醇）又能与包埋介质（石蜡）互溶的液体来置换样品中的脱水剂（乙醇），从而为最终的包埋创造一个有利的条件。 现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿、香柏油等。 一般过程为： 1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，渗透力强，溶蜡量大，易挥发，缺点是易使组织收缩，变硬，变脆。;浸蜡 将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，梯度提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换组织块中的透明剂，便于之后的包理与切片。 浸蜡要在温箱（60℃，???态石蜡）中进行，每级1-3h。 包埋 样品浸蜡后，内部间隙已完全被石蜡占据，接着还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以便切片。用镊子轻轻将浸蜡后的组织块夹入盛有液态石蜡的纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。可同时包埋多块组织。 至此，组织材料的前处理过程已完成，可用于切片。;切片 修块：切片前需修整蜡块，先将大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，再修整成正方体或长方体，从切面看组织周围的石蜡厚度相等(3mm)。 固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台（台木）上，以便于固定在切片机上。 切片：调整切片机刀片位置与台木上的蜡面平行 。一手持毛笔，一手转动切片机，切下的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带根据需要切成数段，放在40℃水面上。 贴片：蜡带分别用粘片剂（蛋白甘油）贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。;脱蜡、水化、染色 蜡带必须先用二甲苯去除石蜡再用乙醇去除二甲苯，再进入水中，才能染色。 染色的方法很多，要根据标本要求显示的目的选择不同的染剂，最常用的是苏木精-伊红染色（H·E 染色）。苏木精使细胞核显深紫色，伊红使细胞质显粉红色，可显示清晰的细胞形态和核的大小，位置。 染色后再使带水的切片经历脱水→透明，最后用树胶封片。;; (l)细胞核染色剂 用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。 (2)细胞质染色剂 用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。 （3）脂质染色剂 用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等。 ;其步骤如下： 二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→苏木精染液→0.01%盐酸→0.01%氢氧化钠→蒸馏水→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→伊红染液→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→二甲苯→二甲苯→封片;;3 石蜡切片实例——鱼肝制片;实验程序： 取材（ 2-3×5×5 mm3）→固定（carnoy3-4h，bouin 12-24h）→洗涤（70%乙醇3-5次）→脱水（80%、90、100、100%乙醇各0.5h）→透明（乙醇+二甲苯等量混合15min，二甲苯15min 2次）→透蜡（二甲苯+石蜡各半