细胞生物学研究方法之细胞组分研究PPT.ppt

第二节 细胞组分的分析方法;第二节 细胞组分的分析方法;离心技术;（一）差速离心 Differential centrifugation;差速离心是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的。 沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒，可以用此法分离。沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开。 如血红蛋白的沉降系数约为4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。 样品离心时，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。;;Low speed;;离心图像中表现几个峰，说明样品中有几个组分，每一个峰代表相应组分的沉降界面，因此可以测定每一个组分的沉降系数值。根据峰的面积可以测量组分的浓度值 一个对称的峰形，一般可以认为样品是离心均一的 ;（二）密度梯度离心;(1) 密度梯度配制好后, 应十分小心放置, 任何摇动或 温度骤变都可能破坏梯度的结构; (2) 应把握好加入样品的体积, 不能超过梯度的分辨能力。直径是2. 5cm 的离心管, 可加1. 0～3. 0ml 的样品。 一般而言, 在较长的梯度柱上铺较薄的样品带, 能获得较高的分辨率, 具体的加样量, 还要根据梯度的斜率、样品在离心过程中的丢失量及经验来判断; (3) 加样也是决定梯度离心效果的重要因素, 要尽量轻 巧, 避免样品与梯度混合。;1. 速度沉降 velocity sedimentation ;2.等密度沉降 isopycnic sedimentation;Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation;二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法;DNA特异性的显示方法 多糖的显示方法 脂类物质的显示 细胞中各种酶的显示 蛋白质显色方法 ;DNA特异性的显示方法;多糖的显示方法;脂类物质的显示方法;细胞中各种酶的显示方法;蛋白质显色方法;（2）双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。该反应是肽键常用的反应，即在碱性铜溶液中，肽键与铜离子形成络合物，呈紫色(在540nm有最大光吸收峰)。 （3）考马斯亮蓝法： 即蛋白质与一种蛋白质染料考马斯亮蓝G250反应形成复合物，该复合物在595nm有最大光吸收峰。 （4）Millon反应：氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的络氨酸残基反应，形成红色沉淀，（有色复合物）;三、特异蛋白抗原的定位与定性：;基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。;免疫荧光技术;;;免疫电镜技术;;胶体金颗粒带电情况?????? 抗体和金颗粒的耦联（图出处：IVD Technology） ;;;四、细胞内特异核酸的定位与定性;人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 ;基因组原位杂交大小麦杂交后代中大麦遗传物质的鉴定;以特异序列为探针鉴定rDNA在染色体上的分布 ; 五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态;;;流式细胞仪;正负不同的电荷， 液滴流经带有几千伏特的偏转板 在高压电场的作用下偏转，收集容器中 从而实现细胞的分离。;;;显微分光光度测定技术;第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术;一、细胞的培养;Hela细胞（左）、CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞 右）的培养;细胞培养： 将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程。 动物细胞培养的基本过程： 取材 分离细胞 选择相同类型的细胞 贴壁培养 传代;;（一）动物细胞培养;细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，但有极少数细胞可能渡过危机而传下去，这些细胞一般又可顺利传代40-50代，并且保持染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。这种传代细胞称为细胞株。 细胞系：由细胞株传至50代后又出现危机不能再传下去，但是如果有部分细胞发生了遗传突变就有可能在体外培养的条件下无限制地传下去。这些细胞具有癌细胞的特点，这种传代细胞称为细胞系。细胞系的特点是染色体发生明显变化，失去接触抑制的特性。;实验室中常用的几种细胞系;细胞培养的意义;（二）植物细胞培养;Pla