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原理与技术PPT课件
PCR原理与技术王秀娟Ph.D. candidatewangxj@PCR原理PCR-polymerase chain reaction 聚合酶链式反应,实际上是一种体外的DNA复制技术。因此,它的过程与体内DNA复制有相似之处,只不过在体外就得采取体外的技术方法达到生物体内的效果。体内DNA复制首先是将双链DNA打开,使用的是解旋酶。PCR技术是通过升高温度变性的方法。体内DNA复制的引物由RNA聚合酶来完成,PCR是通过降温使人工合成的引物退火。延伸都是聚合酶发生作用的阶段,只不过体内体外的温度不同。PCR原理PCR过程:变性、退火、延伸,此过程循环反应。变性就是将双链的DNA打开,使其变成单链,以使引物可与其结合(碱基互补配对)。变性的方法就是升高温度到94℃-98℃,温度因酶而异。退火就是缓慢降低变性温度至引物与模板结合。延伸就是将温度升到聚合酶活性最佳温度,进行聚合反应。以上3个过程完成一次为一个循环,一般PCR可以进行25-35次循环。扩增2^25-35倍。PCR原理从PCR的过程可知道,PCR反应的进行需要的条件为:DNA聚合酶模板引物原材料和能量——dNTP反应发生所需要的水盐环境还有外部环境条件——温度(PCR仪提供)PCR经典反应条件25-35个循环94℃3min (预变性)94℃30s(变性)60℃30s(退火)72℃1min(延伸)72℃10min(充分延伸)4℃hold (可有可无)PCR反应体系Taq酶 (有很多种聚合酶)Buffer(反应所需要的缓冲液,含镁离子等)dNTP模板DNA (来自基因组DNA, 质粒,cDNA等)引物DNA(公司合成)无核酸酶的水PCR反应体系参数(4)dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性PCR反应体系参数(5) Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降; Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度循环参数(1)变性 使双链DNA解链为单链 94℃ 20-30秒(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。循环参数(3)延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定(4)循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多:扩增效率降低 错误掺入率增加PCR动画引物设计原则① 引物设计必须具有特异性,应在没有同源序列的区域内设计② 引物长度一般在15~30碱基之间③ G+C含量在40%~60%之间④ 引物尽量不形成二级结构,引物之间尽量不形成二聚体⑤ 碱基要随机分布,引物自身不能有连续5个以上的相同碱基⑥ 引物5′端可以修饰,引物3′端必须严格互补⑦ 引物3′端要避开密码子的第3位,并且尽量不要用A⑧ 引物设计要跨内含子或隔内含子 ⑨ 注意mRNA 有不同的isoform,不同的引物可能针对不同的isoform进行扩增引物设计常用资源Primer Premier 5Oligo 6Beacondesigner普通引物设计及分析Primer Express? Software(AB corporation)real-time 引物设计专用Primer bank/primerbank/网上real-time引物库PCR的种类普通PCR反转录PCR(rt-PCR) 巢式PCR反向PCR不对称PCR实时PCR(real-time PCR,RT-PCR)/p-081712353458.htmlrt-PCR反转录PCR是一种将逆转录和PCR技术偶联起来,检测基因表达的转录水平的一种技术。它是先利用逆转录酶将RNA转录成cDNA,然后以cDNA为模板做PCR。常用的逆转录酶有:鸟成髓细胞瘤病毒来源的AMV、Moloney 鼠白血病病毒来源的M-MLV rt-PCR有一步法和两步法两种。一步法和两步法一步法:逆转录和特异性扩增在一管内完成,需用基因特异性引物两步法:先逆转录得到cDNA ,再分别进行扩增,需用Oligo dT 或随机引物 两者区别:一步法简单,减少污染的几率,可适用于大量样品和定量分析,但一次只能分析一个基因,cDNA 不能重复利用;两步法比较灵活,一次逆转录可以检测多个基因,方便进行比较,推荐使用两步法逆转录模板:提取的RNA底物:dNTP Oligo dT适用于真核生物的mRNA 逆转录,对RNA样品质量要求高,甚至可以得到全
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