原理与技术PPT课件.pptx

PCR原理与技术王秀娟Ph.D. candidatewangxj@PCR原理PCR-polymerase chain reaction 聚合酶链式反应，实际上是一种体外的DNA复制技术。因此，它的过程与体内DNA复制有相似之处，只不过在体外就得采取体外的技术方法达到生物体内的效果。体内DNA复制首先是将双链DNA打开，使用的是解旋酶。PCR技术是通过升高温度变性的方法。体内DNA复制的引物由RNA聚合酶来完成，PCR是通过降温使人工合成的引物退火。延伸都是聚合酶发生作用的阶段，只不过体内体外的温度不同。PCR原理PCR过程：变性、退火、延伸，此过程循环反应。变性就是将双链的DNA打开，使其变成单链，以使引物可与其结合（碱基互补配对）。变性的方法就是升高温度到94℃-98℃，温度因酶而异。退火就是缓慢降低变性温度至引物与模板结合。延伸就是将温度升到聚合酶活性最佳温度，进行聚合反应。以上3个过程完成一次为一个循环，一般PCR可以进行25-35次循环。扩增2^25-35倍。PCR原理从PCR的过程可知道，PCR反应的进行需要的条件为：DNA聚合酶模板引物原材料和能量——dNTP反应发生所需要的水盐环境还有外部环境条件——温度（PCR仪提供）PCR经典反应条件25-35个循环94℃3min （预变性）94℃30s（变性）60℃30s（退火）72℃1min（延伸）72℃10min（充分延伸）4℃hold （可有可无）PCR反应体系Taq酶 （有很多种聚合酶）Buffer（反应所需要的缓冲液，含镁离子等）dNTP模板DNA （来自基因组DNA, 质粒，cDNA等）引物DNA（公司合成）无核酸酶的水PCR反应体系参数（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性PCR反应体系参数（5） Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度循环参数（1）变性 使双链DNA解链为单链 94℃ 20-30秒（2）退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。循环参数（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加PCR动画引物设计原则① 引物设计必须具有特异性，应在没有同源序列的区域内设计② 引物长度一般在15~30碱基之间③ G+C含量在40%~60%之间④ 引物尽量不形成二级结构，引物之间尽量不形成二聚体⑤ 碱基要随机分布，引物自身不能有连续5个以上的相同碱基⑥ 引物5′端可以修饰，引物3′端必须严格互补⑦ 引物3′端要避开密码子的第3位，并且尽量不要用A⑧ 引物设计要跨内含子或隔内含子 ⑨ 注意mRNA 有不同的isoform，不同的引物可能针对不同的isoform进行扩增引物设计常用资源Primer Premier 5Oligo 6Beacondesigner普通引物设计及分析Primer Express? Software（AB corporation）real-time 引物设计专用Primer bank/primerbank/网上real-time引物库PCR的种类普通PCR反转录PCR（rt-PCR） 巢式PCR反向PCR不对称PCR实时PCR（real-time PCR，RT-PCR）/p-081712353458.htmlrt-PCR反转录PCR是一种将逆转录和PCR技术偶联起来，检测基因表达的转录水平的一种技术。它是先利用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后以cDNA为模板做PCR。常用的逆转录酶有：鸟成髓细胞瘤病毒来源的AMV、Moloney 鼠白血病病毒来源的M-MLV rt-PCR有一步法和两步法两种。一步法和两步法一步法：逆转录和特异性扩增在一管内完成，需用基因特异性引物两步法：先逆转录得到cDNA ，再分别进行扩增，需用Oligo dT 或随机引物 两者区别：一步法简单，减少污染的几率，可适用于大量样品和定量分析，但一次只能分析一个基因，cDNA 不能重复利用；两步法比较灵活，一次逆转录可以检测多个基因，方便进行比较，推荐使用两步法逆转录模板：提取的RNA底物：dNTP Oligo dT适用于真核生物的mRNA 逆转录，对RNA样品质量要求高，甚至可以得到全