基因工程-3章 基因工程载体PPT.ppt

第三章 基因工程载体 ;一、概 述;(二)基因载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 ;(三)基因载体具备的特性;⑤载体本身分子量比较小,可容纳较大外源基因片段。 ⑥载体在细胞内的拷贝数高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 ⑦载体在细胞内稳定性高，保证重组体稳定传代而不易丢失。 ⑧载体都是安全的，不含对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞。;(五)基因载体的致死效应;二、质粒载体; 克隆载体(cloning vector)：是指用于扩增或保存外源DNA片段而设计的载体。 克隆载体的结构特征;*;2.质粒的生物学特性;*;3.质粒载体的发展概况;4.质粒的标记基因(又称报告基因);*;4.2 筛选标记基因;*;(2)α-互补(α-complementation) 是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的LacZ基因的突变体之间实现互补，从而产生具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白，这种现象就称为α-互补。;*;5.质粒载体的多克隆位点;6.质粒DNA的分离和纯化;⑴碱变性抽提法原理;*;*;⑶碱抽提法所用试剂的生化作用 ;①溶菌酶: 糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学键——肽聚糖β-1,4糖苷键。∴具有溶菌作用。 葡萄糖: 增加溶液粘度，维持渗透压，防止机械剪切力对DNA的降解。 EDTA(乙二胺四乙酸): 螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶活性(抑制DNA降解), 有利于溶菌作用和DNA完整释放。 ;②NaOH-SDS液: NaOH浓度为0.2 mol/L，加入抽提液时，该系统的pH高达12.6，引起染色体DNA和质粒DNA变性。 SDS(十二烷基磺酸钠)——离子型表面活性剂，可溶解细胞膜脂质与蛋白，破坏细胞膜； 解聚核蛋白，能与蛋白质结合成R-O-S03-…R+一蛋白质复合物,使蛋白质变性沉淀下来。;③KAc: pH4.8 KAc溶液可将pHl2.6的抽提液调节至中性→使变性质粒DNA复性，并稳定存在于溶液中。 3mol/L高盐KAc→染色体DNA变性、RNA、SDS-蛋白复合物凝聚沉淀。 因为染色体DNA核酸上电荷被中和，减少斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用，形成钾盐复合物，使沉淀更完全。 ;④无水乙醇: 沉淀DNA 优点：具有很强的吸水性，可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不起任何反应，对DNA很安全。 DNA溶液(DNA以水合状态稳定存在)，当加入乙醇时，乙醇将夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而聚合。 ;⑤苯酚-氯仿溶液:苯酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白质水溶液与苯酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被苯酚或氯仿挤出，使蛋白质失水而变性。 密度：苯酚-氯仿＞变性蛋白质＞水相 离心：从上到下： 上层：水相； 中间：变性蛋白质； 下层：苯酚-氯仿 使变性蛋白质与水相中的DNA分开！;⑥异戊醇: 降低分子表面张力，减少抽提过程中泡沫的产生。 此外，有助于相的稳定。使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 ;7.常用质粒载体;*;⑴pBR322质粒载体;pBR322质粒载体的优点;*;⑵pUC质粒载体;*;*;pUC质粒载体的优点： 具有较小的相对分子质量和更高的拷贝数，可达500-700个拷贝/细胞。 适用于组织化学方法检测重组体,有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的?-肽链可参与?-互补作用，在IPTG诱导和底物X-gal存在下，形成蓝色和白色菌落筛选重组体。 具有多克隆位点，便于目的基因克隆。;*;8.质粒载体的用途 ;*;*;*;*;λ噬菌体侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。 λ噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。 λ噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原。;*;1.λ-DNA载体的构建 1.1 缩短长度 野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。;1.2 删除重复的酶切位点;1