第十二章 固相膜免疫测定 - 长沙医学院.pptVIP

GIFA技术的发展 第一代 1988 HIVCHEK（DuPont） 单点， 5~10分钟， 血清， 金标试剂瓶装冻干品 改进抗原HIV 1+2，提高敏感度和特异性，缩短反应时间，减少步骤，样品多样化 。 第八代 INSTANTCHEK HIV 1+2 2点（测试+控制） 金标试剂：单人份、液体 样品： 血清、血浆、全血、 尿液 第九~十二代 研制中 单一试剂 * ICA技术的发展 1990年 ABBOTT公司 胶体硒标记ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.1~3 ng/ml 合成TnT质控点 * IFA 肌红蛋白 双孔法 S：测定孔 C：定量质控 100μg/L IFA 微量白蛋白 单孔法 T：测定孔 C1：定量质控 30 mg/L C2：定量质控 200 mg/L 结果判定： （-） 30 （+） 30~100、 （++） 100～200 （+++） 200 mg/L ICA 甲胎蛋白（AFP） 参考值：30 μg/L 肝癌诊断值：400 μg/L 结果判定： （-） 30 （+） 30~200 （++） 200~400 （+++） 400 μg/L S C T C2 C1 测 定 线 对 照 线 半定量测定 * 三、斑点酶免疫吸附试验 ——Dot-ELISA * 四、酶联免疫斑点试验—— ELISPOT 20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT)。 * ELISPOT 检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL 公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。 * * ELISPOT 分析仪解决以下问题 哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值） 斑点大小的意义 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸 如何从单个细胞基础上分析 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？ 几次重复实验才能使结果更有意义？ * ELISAPOT * ELISPOT结果判断 * 方法学评价 * 五、免疫印迹法——Westernblot法 原理 Westernblot——抗原表位可能被破坏而漏检 * 六、放射免疫沉淀试验 原理 放射免疫沉淀试验——抗原表位不会破坏 * 思考题 1. 叙述固相膜免疫测定概念。 2．膜的种类与特性是什么？ 3．膜载体免疫测定的种类有哪些？ 4．斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)的原理是什么？ 5．免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）的原理是什么？ * 6．斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 原理是什么？ 7．酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 原理是什么？ 8．免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 原理是什么？ 9．免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 注意事项是什么？ 10．放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 原理是什么？ * 小 结 固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测