唐山地区食管癌患者癌组织中HPV1618感染及p53基因多态性检.docVIP

唐山地区食管癌患者癌组织中HPV1618感染及p53基因多态性检 　　[摘要] 目的 探讨HPV16/18感染和p53基因多态性与唐山地区食管癌的关系。 方法 收集唐山地区食管癌患者45例，食管良性肿瘤20例，健康对照组20例，采用原位杂交法检测HPV16/18，用PCR-RFLP方法检测p53基因多态性，对照分析其与食管癌发生率的关系。 结果 食管癌组患者、食管良性肿瘤与健康对照组HPV16/18检出率分别为88.9%、5.0%、2.5%，食管癌组患者HPV16/18检出率明显高于其他组（P 　　[关键词] 食管癌；p53基因；基因多态性；人乳头状瘤病毒 　　[中图分类号] R735.1 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2012）10（c）-0154-03 　　食管癌是常见的十大恶性肿瘤之一，其发病率与地理区域、饮食习惯、遗传因素、和病毒感染等有关。其发生、发展涉及多因素、多步骤相互作用的复杂过程，且与多种基因的表达改变紧密相连[1]。故通过了解相关基因如何表达和调控机制，为探查食管癌的病因及治疗提供新的理论基础。近年来具有高致病性的人乳头状瘤病（HPV）16/18与食管癌的相关性备受学者的关注。笔者收集唐山地区食管癌患者资料，探讨HPV16/18感染和p53基因多态性与食管癌的关系。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选择2005年5月～2010年11月在迁西县人民医院手术或胃镜活检共85例唐山地区食管疾病患者的新鲜食管组织标本，45例为食管癌患者，其中，男31例，女14例；年龄45～73岁，平均（56.7±5.8）岁；临床分期按照国际食管癌会议制定的标准分期为Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例；有淋巴结转移16例，无淋巴结转移29例。另外20例良性肿瘤，20例正常食管组织。所有病例均经术前快速冷冻病理和术后常规病理检查确诊，术前均行未化疗、放疗及免疫治疗。 　　1.2 方法 　　1.2.1 HPV16/18的检测 采用原位杂交试剂盒和生物素标记的高危HPV16/18 DNA探针，与蜡块切片做DNA原位杂交。切片于60℃～70℃烘烤60 min脱蜡，置入杂交增强液里，高火加热30 min，冷却后用蒸馏水洗涤，滴加杂交液后盖上盖玻片，置原位PCR仪95℃变性5 min后，转入含30%湿盒增效液的湿盒中，维持37℃过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡洗片，擦干后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，37℃孵育30 min，PBS浸泡洗??，擦干后滴加动物非免疫血清，室温孵育20 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加DAB显色液，室温孵育10 min，PBS浸泡洗片，擦干后苏木素复染。常规封片，镜检。试验阳性对照：已知HPV16/18阳性的食管癌切片。 　　1.2.2 基因多态性分析 采用PCR-RFLP方法检测p53基因第4外显子72密码子多态性。先行引物设计，引物序列（5→3），正向引物CAACACCATAGCAGTAGCAGC，反向引物CAGCCTCTCCTTCATACAGCC，按照试剂盒使用说明书对食管癌患者癌组织及其他标本提取DNA模板，而后行p53基因第四外显子PCR扩增，利用限制性内切酶对PCR扩增产物酶切后用2%的琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统中观察结果。 　　1.3 结果判断 　　HPV16/18原位杂交阳性信号为棕黄色颗粒，主要定位在细胞核和细胞质内。对肿瘤细胞的观察标准，阳性（+）：细胞核或质内见棕黄色颗粒，阴性（-）：细胞不着色。p53基因不同形态鉴定：仅在413 bp处显示条带的为Pro/Pro基因型，分别在253 bp和160 bp处出现条带的为Arg/Arg基因型，而在413 bp、253 bp、160 bp均有条带出现的为Pro/Arg基因型。 　　1.4 统计学方法 　　采用SPSS 13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。以P 0.05）。见表3。 　　3 讨论 　　全世界每年食管癌发病人数大于30万，其中一半在中国。其中环境因素、亚硝胺及营养因素为食管癌的主要病因因素，但其确切病因及发病机制仍未明了，因此展开了大量针对食管癌的分子生物学研究，其目的就是为了找出食管癌确切病因及发病机理，这为食管癌疾病临床的早发现、早诊断和早治疗起着决定性的作用[2]。近年研究发现HPV感染可能在食管上皮癌变中也起一定作用，并认为HPV感染下，可刺激或逐步引导并最终破坏原癌基因与抑癌基因之间相互依存、相互制约的平衡，致使细胞信号传导和细胞周期紊乱，使突变细胞出现异常增殖。目前p53基因已成为研究比较透彻的一种抑癌基因，一致认为其与细胞周期调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。该基因的缺损或突变常常被证实与肿瘤的发生有关，自1998年首次报道p53第72密码子