药物血清内黄芪甲苷含量测定及其抑制HSCs活化增殖实验研究.docVIP

药物血清内黄芪甲苷含量测定及其抑制HSCs活化增殖实验研究 　　 　　摘 要：目的：探讨黄芪经正常、肝纤维化机体代谢后血清内黄芪甲苷含量差别，及其对肝纤维化发生中HSCs活化增殖的影响。方法：40%CCl4, 皮下注射9周制备大鼠肝纤维化模型。正常、肝纤维化大鼠分别灌服黄芪，提取正常、肝纤维大鼠药物血清，HPLC检测药物血清内黄芪甲苷含量。CCK-8法检测黄芪甲苷对HSCs增殖影响，3-Pro掺入－胶原酶消化法检测黄芪甲苷对HSCs胶原分泌的影响。结果：正常、病理药物血清内均可检出黄芪甲苷。病理药物血清内黄芪甲苷含量高于正常药物血清(0.1140 vs0.0851,P 　　黄芪是中医补益补气一味重要用药，能够提高机体免疫功能，抑制脂质过氧化，稳定肝细胞膜。以黄芪为主的组方，对于慢性肝病的防治作用已在动物实验、细胞培养及临床应用中得到证实\[1\]。黄芪主要含皂苷类、多糖类和多种黄酮类成分。其中，黄芪???苷Ⅳ又称黄芪甲苷，为黄芪内主要有效成分\[2\]。血清药理学方法采用健康及病理造模动物为药物受体，灌服中药后取其药物血清体外干预细胞，可准确反应中药经机体代谢后所产生有效成分的体内作用\[3\]。 　　 肝纤维化是肝硬化的必经阶段\[4\]。肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）的活化增殖是肝纤维化的启动因素和细胞学基础\[5\]。本文采用HPLC检测黄芪经正常、肝纤维化机体代谢后黄芪甲苷含量差别，同时探讨黄芪甲苷对HSCs活化增殖的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 动物造模 健康雄性SD大鼠20只，清洁级，购自河北医科大学实验动物中心，分为两组。A组（正常对照）：正常健康SD大鼠10只；B组（肝纤维化组）：SD大鼠10只，进行9周肝纤维化造模：大鼠皮下注射40％CCl4油溶液，首次注射剂量为每千克体重4mL；首次注射后，注射剂量改为每千克体重2mL。每周注射2次，持续注射9周。 　　1.1.2 细胞培养 肝星状细胞株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠赠，其表型为活化的HSCs，从CCl4诱发的肝硬化大鼠中分离并在体外培养中使细胞自发获得永生性。 　　1.1.3 仪器 高效液相色谱仪（美国Waters公司），810型控制器，486型紫外检测器，色谱工作站（大连依利特）。微孔滤膜（美国 Millipore Corporation，孔径0.45μm）。Sep-Park C18净化柱（美国Waters Millipore）。AUTOSCIENCE超声发生器。Ultrafree-MC Filters (Millipore，10,000 NMWL Filter Unit)。中药自动煎药机（韩国东华）。 　　1.1.4 试药 黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；黄芪产地山西，由河北省乐仁堂医药有限公司提供，经河北医科大学姚希贤教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪的干燥根。 　　1.2 供试品溶液制备 　　1.2.1 黄芪灌服煎液 黄芪生药浸30min后，采用自动煎药机煎制黄芪灌服液，并将其浓缩至所需浓度（含黄芪生药0.05 g·mL-1）。 　　1.2.2 黄芪药物血清HPLC供试品 SD大鼠正常对照组（A组），备提取正常药物血清用；肝纤维化组（B组），进行肝纤维化造模，9周后B组可见肝组织明显的坏死，炎细胞浸润，脂肪变性。A组大鼠无明显变化见图1。9周后黄芪煎液同时灌服正常、肝纤维化大鼠（灌服量为大鼠体重每千克6.25g生药，为成人千克体重用量约15倍）。连续灌服5天。于第5天灌服后2h，大鼠下腔静脉取血5mL，离心分离药物血清。药物血清加入等体积乙腈，离心2次去蛋白。取第2次离心上清，微孔滤膜过滤，Sep-Park C18小柱净化，超滤试管过滤，取续滤液作为黄芪药物血清HPLC供试品溶液，4℃避光保存。 　　1.2.3 黄芪生药HPLC供试品制备 精密称取黄芪粉末5.0g，放入100mL容量瓶中，加甲醇定容至100mL，充分混匀，4℃避光12h过夜。次晨溶液经微孔滤膜过滤，Sep-Park C18小柱净化，超滤试管再次过滤后，取续滤液上清为黄芪生药HPLC供试品溶液（含黄芪生药0.05g.mL-1），4℃避光保存。 　　1.3 色谱条件 　　 色谱柱：Nucleasil 100-5 C18色谱柱(250mm×46mm, 5μm)；流速：0.8mL·min-1；检测波长：200nm；柱温：25℃；流动相∶ 乙腈-水(1∶ 2)；AUFS：0.1\[6\]。 　　1.4 HPLC方法与结果 　　1.4.1 线性关系考察 配制浓度为0.5mg·mL-1的黄芪甲苷标准品溶液，按不同梯度体积进样(2、5、8、1