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* * MSI 检测技术 微卫星简要介绍 现用微卫星检测技术流程 多重荧光PCR技术概略介绍 毛细管电泳概略介绍 微卫星检测的临床检测可行性 MSI 检测技术摘要 MS Simple repeat sequences of 1 to 6 base pairs 单核苷酸型:AAAAAAAA.. 双核苷酸型:ATATATAT.. 三核苷酸型:ATCATCATC.. ……. MS Prone to replication errors Defection of MMR MS instability LS Sporadic MSI LS MS 错误产生机制 Stutter 又被称为影子带，或者DNA聚合酶滑脱产物。表现为PCR产物比主要扩增产物增加或减少一个或几个重复单位。 实验流程 1、基因DNA的提取 2、多重荧光PCR 3、毛细管电泳检测 4、分析数据 基因DNA的提取流程 Promega试剂盒法 分别挑选正常、肿瘤组织 显微切割 多重荧光PCR Disease Markers 20 (2004) 237–250 Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan 上游引物的5’端作荧光标记 JOE~Green FL ~Blue TMR~Black 多重荧光PCR PCR反应体系（25μl）： 2.5μl GoldST★R 10X Buffer 0.1-1 μM each primers 0.05 μl AmpliTaq Gold DNA Polymerase(5Units/ μl) 1-2ng DNA PCR条件：1 cycle 95?C for 11minutes; 1 cycle 96?C for 1 minute; 10 cycles 94?C for 30 sec-onds, ramp 6 seconds to 56?C, hold for 30 seconds,ramp 50 seconds to 70?C, hold for 45 seconds; 20 cycles at 90?C for 30 seconds, ramp 60 seconds to 56?C,hold for 30 seconds, ramp 50 seconds to 70?C, hold for45 seconds; 60?C for 30 minutes final extension; 4?C hold. Disease Markers 20 (2004) 237–250 Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan 毛细管电泳检测、分析 微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后，取适量PCR产物、分子内标(ILS 600)溶于缓冲液（甲酰胺）中经遗传分析仪毛细管电泳进行扫描，通过检测片段长度来判断微卫星不稳定性。 利用Genescan和Genetyper软件进行图像收集和分析，计算出微卫星等位变异扩增片段的大小。 Promega MSI Analysis System, Version 1.2 横坐标代表片段长度 纵坐标代表荧光强度 多重荧光PCR优点 多重PCR技术是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对，同时扩增多个序列，从而产生高度特异性的反应过程，该技术对DNA模板要求量小、高通量分析且省时、省力、省材。 应用不同荧光标记可以解决不同PCR扩增位点长度的重叠，极大的提高效率。 多重荧光PCR前提条件 所有引物对的退火温度必须接近； 在同一反应体系中，所有引物对之间不能有相互作用（形成引物寡聚体）； 同色引物扩增产物应长度有别，这样才可同时对多个位点进行片段分析。 *