全血基因组DNA的提取PPT.pptVIP

Molecular Biology 分子生物学检验技术 分子生物学 分子水平 研究对象 DNA及RNA 其表达产物蛋白质 探讨生命现象 遗传 功能 关系、作用 以超乎想象的速度飞速发展，渗透到医学每一个领域。 与临床检验诊断学关系 使疾病诊断深入到基因水平 基因诊断 可以毫不夸张的说，如果没有分子生物学的应用， 人类探索生命活动的行为将会寸步难行。 分子生物学检验技术的应用 本学期实验内容 1 2 3 理论考试占70%，实验成绩占30% 真核基因组DNA的分离纯化 （1）核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都 以与蛋白质结合的状态存在。 （2）真核生物的染色体DNA为双链线性分子； 分离核酸注意事项： （1）减少化学因素对核酸的降解。 （2）减少物理因素对核酸的降解。 （3）防止核酸的生物降解： 策略：新鲜生物组织或细胞样品。 核酸提取的主要步骤： 一般为破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。 一、实验目的与意义 （一）目的：掌握全血DNA提取基本技能。 （二）意义：基因组DNA含有细胞中全部的遗传信息， 从全血中提取DNA是遗传性疾病、胎儿产前无创 伤诊断、肿瘤和传染性疾病等的早期确诊的重要 手段和技术，DNA提取的质量和产量直接影响PCR 扩增、分子克隆、限制性内切酶的酶切反应等试验 的成败。 （三）常用提取方法： 有机溶剂抽提法（氯仿-异戊醇法） 盐析法（经典Miller盐析法） NaI法 …… NaI法提取外周血白细胞DNA，提取的DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列。通过本实验学习和掌握NaI法提取DNA。 二、实验原理 从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全，DNA存在于上层水相中，以异丙醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，70%酒精干燥，即可获得白细胞DNA。 1、高速离心机。 2、全血DNA提取试剂盒（TaKaRa宝生物工程公司） 试剂盒组成： GenTLE solution Ⅰ 1瓶 GenTLE solution Ⅱ 2瓶 GenTLE solution Ⅲ 1瓶 3、异丙醇、70%乙醇。 三、实验材料 各试剂成分作用： GenTLE solution Ⅰ： 破坏血细胞同时，与核酸形成电中性的复合体。 GenTLE solution Ⅱ： 复合体离心收集后清洗，洗涤作用。 GenTLE solution Ⅲ： 将DNA从核蛋白中解离出来。 异丙醇：将DNA沉淀回收。 70%酒精：利用DNA不溶于酒精的特性，去除DNA沉淀中 残留的盐类分子。 四、实验流程与要求 新鲜全血的收集 全血DNA的提取 提取DNA质量的初鉴 经各种抗凝剂处理过的全血 （EDTA、柠檬酸或肝素） 按试剂盒说明书操作。见后 1、琼脂糖凝胶电泳初步鉴定； 2、测定DNA浓度及纯度； A260/A280比值 全血DNA的提取 （1） 100ul混匀的全血 GenTLE Solution I 500ul （2） 振荡混匀数秒 （3） 室温放置10min以上 （4） 12,000rpm离心5min(20℃以上离心) （5） 小心去除管中液，枪头不 要碰到离心管内壁（防止 吸走沉淀物） 此时沉淀看不清。 （6） 加入1ml GenTLE Solution Ⅱ 沿管内侧内壁加入到离心管中 轻柔颠倒离心管2-3次，室温 12,000rpm离心2min,去除上清。 （7） 加入500ul GenTLE Solution Ⅲ 轻微振荡10s充分混合。