动物细胞培养pptPPT.ppt

动物细胞培养学习（一）;前 言 ;组织培养中热门的研究领域 ;组织培养的分类及基本概念 ;组织培养的细胞生物学特点: ;不适应（Deadaption） 细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。 脱分化（Dedifferentiation） 由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力;不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。;培养细胞的形态 ;培养细胞的生长和增殖 ;3.衰退阶段： 自发性转化（Spontaneous Transformation）：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）: 细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite cell line)或连续细胞系(Continuous cell line)。 ;培养细胞的传代培养 ;细胞传代的三个阶段 ;2) 指数生长期（Logarthmic growth phase）： 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。;3)停滞期（Stagnate phase）： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。;细胞培养的基本条件 ;细胞培养的基本条件;6)其它添加成分： 缓冲系统，常用为HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31； HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。 有机补充物，如丙酮酸钠， 谷胺酰氨等。 促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。 贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。 可根据培养细胞的特殊要求进行添加。;培养液的物理性质 ;渗透压：培养液渗透压一般介于260~320 mosm/kg之间。 人类血浆渗透压290mosm /kg，小鼠类为310mosm /kg。 粘度：由于血清的存在，直接影响培养液粘度。 表??张力：培养液的表面张力有利于培养物粘着于底物上面。;细胞培养的基本方法 ;解离细胞;解离细胞的方法;原代细胞培养 ;3）悬浮细胞培养：使细胞成悬浮状态在培养液中连续生长。 由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞； 通过机械搅动使细胞保持悬浮状态； 通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。;培养细胞的污染问题及检测 ;细胞污染的种类和判定 ;污染物的检测 ;;支原体检测方法和处理 ;5）污染支原体后的处理： 抗生素处理：如加入泰乐菌素等。 共培养法：与巨噬细胞共培养。 重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4~5周后，重复克隆2次。 过滤法：0.22μm孔径滤膜正压过滤。;污染病毒的检测 ;细胞间交叉污染;在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。 ;1、 冷冻速率 冷冻速率是指降温的速度，是活细胞能否被冷冻到一个能永久保存的温度的一个主要因素。冷冻速率太快或太慢都会造成细胞的损伤，只有以最适的冷冻速率冷冻细胞，才能获得最佳的冷冻保存效果。 不同细胞最适冷冻速率的值也有所不同，所以一种细胞冷冻保存之前要测试出其最适冷冻速度，拟保证获得最高冷冻存活率。 ;2、复温速率 一般来说复温速度越快越好，37℃水浴中，1～2分钟内要完成复温。;3、冷冻保护剂 冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，常被加到一定的溶液中进行配制，作为冷冻保护液。红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳类动物细胞悬浮在水或简单的盐溶液中而不加冷冻保护剂，以最适的冷冻速率冷冻保存可获得活的冻存物。 ;对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、