分子生物学研究法PPT.ppt

2、 碱变性法 在pH值12.0~12.5时加热DNA溶液，线 性DNA 会被变性，两条链完全分开。闭 合环状质粒DNA不会被变性，尽管连接 DNA 互补链之间的氢键也会断开，但由 于闭合环状质粒DNA的双螺旋主链彼此 盘绕，两条链仍然结合在一起。 致冷或恢复中性pH后，共价闭合环状 的质粒DNA能迅速而准确地复性。 5. 3. 2 重要的大肠杆菌质粒载体 1、pSC101质粒载体 是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠 杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1~2个 拷 贝 。 长 9.09kb ， 编 码 有 四 环 素 抗 性 基 因 （ tetr ） ， 具 有 EcoRI 、 HindIII 、 BamHI 、 SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核 酸内切酶的单切割位点，在HindIII、BamHI 和SalI 等3 个位点克隆外源DNA ，都会导致 tetr基因失活。 pSC101质粒有可插入外源DNA的多 个内切酶单克隆位点和四环素抗性 强选择记号，是第一个真核基因克 隆载体。 缺点：它是一种严紧型复制控制的 低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主 细胞中提取pSC101 DNA，产量很 低。 图5-21 大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。 2、ColE1质粒载体 ColE1 质粒属于松弛型复制控制 的多拷贝质粒。正常生长条件下， 当培养基中氨基酸被耗尽，或是在 对数生长末期的细胞培养物中加入 氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主 染色体DNA 的复制便被抑制，细胞 的生长也随之停止。 松弛型复制控制的质粒DNA 仍 然可以继续进行复制达数小时之 久，使每个寄主细胞中所累积的 ColE1 质粒拷贝数增加到1000~3000 个之多，质粒DNA大约可占细胞总 DNA的50%左右。 3、pBR322质粒载体 由三个不同来源的部分组成的：第一 部分来源于pSF2124 质粒易位子Tn3 的氨苄青霉素抗性基因（ampr）； 第二部分来源于pSC101 质粒的四环 素抗性基因（tetr）； 第三部分则来源于ColE1的派生质粒 pMB1的DNA复制起点（ori）。 优点是具有较小的分子量，其长 度为4 363bp。不仅易于纯化，而且 即使携带上一段6-8kb的外源DNA片 段，操作起来仍较为便利。 具有两种抗生素抗性基因以用作 转化子的选择记号。有较高的拷贝 数，若经过氯霉素扩增，每个细胞 中可累积1000~3000个拷贝，为重组 体DNA的制备提供了极大的方便。 将外源DNA片段克隆在pBR322质 粒的BamHI或SalI位点上，由于阻断 了tetr 基因编码序列的连续性，使其 失去活性，产生了具有AmprTets 表 型的重组的pBR322质粒。 图 5-22 pBR322 质 粒载体的 结构图及 其来源分 析。 4、pUC质粒载体（包括四个部分）： (i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）； (ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr）； (iii) 大肠杆菌β- 半乳糖酶基因（lacZ ）的启 动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特 称为lacZ’基因； (iv)位于lacZ ’基因中的靠近5’-端的一段多克 隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏 了lacZ ’基因的功能。 优点： 更小的分子量和更高的拷贝数。在 pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅 保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复 制 起 点 ， 其 分 子 小 了 许 多 ， pUC8 为 2750bp ， pUC18 为 2686bp 。 由 于 缺 失 rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时， 平均每个细胞即可达500~700个拷贝。 可用组织化学方法检测重组体。 pUC8 质粒结构中具有来自大肠杆菌lac 操纵子的lacZ 基因，所编码的α- 肽链 可参与α- 互补作用。因此，可用X-gal 显色法实现对重组体转化子的鉴定。 第三，具有多克隆位点MCS区段，可以 把 具 两 种 不 同 粘 性 末 端 （ 如 EcoRI 和 BamHI ）的外源DNA 片段直接克隆到 pUC8质粒载体上。 5、 pGEM-3Z质粒 长度为2743bp，编码有一个氨苄 青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 含 有 两 个 噬 菌 体 启 动 子 （ T7 和 SP6 ），为RNA 聚合酶的附着作用 提供了特异性的识别位点。加入T7 或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源 基因便会转录出相应的mRNA。 6 、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 指由人工构建的具有两种不同复 制起点和选择记号，可在两种不同 的寄主细胞中存活和复制的质粒载 体。由于这类质粒载体可以保证外 源