分子生物学实验方法2分子生物学.pptx

蛋白质是生命活动的主要执行者 蛋白质的功能主要通过与蛋白质以及其他生物分子的相互作用来实现; 举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。 ;生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 ;;蛋白质亲和色谱protein affinity chromatography ?;;融合蛋白pull-down实验; GST融合蛋白在经过固定有GSH(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用; 以上两种方法都有共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能是由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可能是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。实验结果还应经其他方法验证。 ; 以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免人为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 ???? 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白，另外灵敏度不如亲和色谱高。;;在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有一定重叠，当这两个荧光发色基团在足够近（100埃）时，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。;BFPGFP CFPYFP; 荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辨率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。? ????? 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。受荧光发色基团空间距离的限制,只能研究分子量小于200 kD的蛋白，而且检测的设备昂贵。;噬菌体表面展示;丝状噬菌体;;;最关键的优势： 淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能； 所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集； 展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。 ;酵母双杂交技术;优点：简单快速，具有非常高的灵敏度，常用于发现和研究新蛋白的相互作用和功能。 缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性；融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能；要求互作蛋白定位于核内，不利于核外蛋白研究，会导致假阴性。 ; 在酵母双杂交系统基础上发展起来的较为方便、快速和灵敏的检测蛋白质之间相互作用的方法。据原理可分为基于转录激活、基于转录抑制，基于酶片段互补和基于信号级联反应重建的细菌双杂交系统四类。;细菌腺苷酸环化酶型双杂交系统（BACTH) 原理示意图; 这种细菌双杂交技术有效利用了cAMP信号通路，使得融合蛋白的互作和转录机器在空间上分离，因此有效克服了酵母双杂交和其他细菌双杂交系统的一些内在缺陷，如非特异互作，不能用于转录因子和膜蛋白、分泌蛋白的研究等。 筛选快捷，操作简单，成本低廉，非常适合构建快速、低耗、规模化的相互作用筛选技术平台。;缺点 细菌缺乏翻译后修饰系统，真核蛋白不能得到适当地折叠和翻译后修饰，使得该系统筛选到生理作用蛋白的可能性降低。 结构域的引入对目标蛋白的折叠过程或构象可能产生不可预知的影响，从而导致假阳性或假阴性结果。 由于该系统中设计的都是融合蛋白, 因此其特性与单纯的蛋白并不一定精确对应, 这样蛋白质间相互作用的结果可能与真正结果有些误差。;蛋白质芯片( protein microarray);Far-Western? 又叫做亲和印记。将PAGE胶