酶学第九章固定化生物催化剂.doc

第九章 固定化生物催化剂 9.1 酶的固定化方法概述： 酶催化剂可以分为几种主要类型，包括游离酶、游离细胞（发酵）、固定化酶、固定化细胞或细胞器，它们都可以用于工业生产。与游离酶和游离细胞相比，固定化酶和固定化细胞有着特别的优越性。游离酶与底物混在一起反应，随着反应时间的延长，产物积累，反应速度会逐渐下降；只能采用分批法生产，反应结束后酶不能回收；有酶在反应混合液中，给产物的分离增加了困难。发酵需要添加许多营养物质，成本高；易染杂菌；发酵液的成分复杂，产物分离困难；易造成环境污染。固定化酶和固定化细胞操作方便；对微生物污染不敏感；容易实现连续生产和自动化生产，即使是批式生产也能回收生物催化剂反复使用；产物的分离简单；酶经固定化后稳定性增加。使用非增殖的固定化细胞仅需要维持催化反应的能量，因此效率比发酵法高。固定化细胞的生长阶段和催化反应阶段是分开进行的，可以各自选择最优化的条件，而发酵中这两步是在同一设备中同时进行的，操作条件只能是两种要求之间的折衷。 酶固定化的研究最早可以追溯到1916年，Nelson和Griffin首先发现酵母蔗糖酶能被骨碳粉末吸附，并在吸附状态下仍有酶活性。1953年，Grubhofer和Schleith为应用目的而积极开展固定化酶的研究工作，他们将聚氨苯乙烯树脂重氮化，使羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合在树脂上，实现了酶的固定化。1969年千火田一郎等首先在工业生产中应用固定化氨基酰化酶生产L-氨基酸。至今已有多种固定化酶获得工业规模的应用，如固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆，固定化青霉素酰化酶生产6-氨基青霉烷酸，固定化微生物细胞生产L-天冬氨酸和L-苹果酸，固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶等。 安徽医科大学用固定在聚酯片上的杂交瘤细胞，生产用于血型鉴定的单克隆抗体（可查一下1997年2月上旬的健康报）。 固定化酶的制备方法可分为三大类：a. 载体结合法；b. 交联法；c. 包埋法。 9.1.1 载体结合法： 它是将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。 9.1.1.1 物理吸附： 可用于物理吸附制备固定化酶的载体很多，如活性炭、多孔玻璃、酸性白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、淀粉、合成树脂、陶瓷等。此外还有疏水性的载体如丁基或己基葡聚糖凝胶可以疏水性吸附酶。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏，酶的高级结构变化少，操作简便的优点。缺点是酶与载体的结合力弱，酶易脱落。 物理吸附法也能固定微生物细胞。 9.1.1.2 离子结合： 这是通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化方法。作为此法的载体有各种离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树脂等。离子结合法的优缺点与物理吸附法相似，但比物理吸附的结合力要强。当缓冲液的pH发生变化或离子强度较高时，酶易脱落。1969年最早用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用DEAE-葡聚糖凝胶固定的。 9.1.1.3 共价结合： 这是酶以共价键结合于载体的固定化方法。可与载体结合的酶的功能团有α或ε-氨基，α、β或γ-羧基，巯基，羟基，咪唑基，酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当不是酶催化活性所必需的，否则往往造成固定后酶活性完全丧失。共价结合的方法可分为两类，一类是先将载体上的有关基团活化，然后与酶的有关基团偶联；另一类是用双功能分子连接载体和酶。 用于共价结合的载体有葡聚糖、琼脂糖、纤维素、胶原、蚕丝、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、尼龙、活性碳、硅藻土、多孔玻璃、不锈钢、磁性氧化铁、砂等。 共价结合法与物理吸附法及离子交换法相比，反应条件较激烈，操作复杂，会引起酶构象变化，酶活性丧失较多。酶活回收率一般在30％左右，有时甚至连底物的专一性也会发生变化。但酶与载体结合牢固，不易脱落；回收的酶活性稳定性较高。 9.1.2 交联法： 这是用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联成立体化网状结构的固定化方法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。作为交联剂的有形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，产生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等。交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低。尽可能地降低交联剂的浓度和缩短反应时间有利于固定化酶比活性的提高。 氰酸 （H-O-C≡N）, 硫氰酸 （H-S-C≡N）, 异氰酸 （H-N=C=O）, 异硫氰酸 （H-N=C=S）, 异氰酸酯 （R-N=C=O）, 异硫氰酸酯 （R-N=C=S）。 9.1.3 包埋法： 包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶网格中的称为网格型，将酶包埋在球状半透膜中的称为微囊型