生物工程下游技术电泳PPT.ppt

Chapter8 电泳技术Electrophoresis;电解质在电场作用下发生定向泳动的现象。 荷电的胶体粒子在电场中的移动； 电泳分离：利用电解质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。属速度分离法(无平衡现象)。 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。; ;;Stoke’s Law（斯托克斯定律）;8.1.2 电泳的大致分类;区带电泳（zone electrophoresis ） 　是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 ;按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 ;③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质 ; 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。 ;区带电泳的主要技术;8.3.1 凝胶电泳;丙烯酰胺的聚合;影响聚合的主要因素;聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应;分子筛效应;琼脂糖凝胶的性能、结构与特点;电泳新介质;特点：;电泳系统的基本组成;电泳洗脱仪：回收样品 凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果。;;;;;垂直电泳槽及灌胶模具;常规聚丙烯酰胺凝胶电泳;电泳前的准备工作;缓冲系统的选择原则;离子强度的选择;凝胶浓度的选择;凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置； 凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离；;凝胶浓度 (C=2.6%);PAGE的具体操作过程;SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS的原理;蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变;未知蛋白质分子量的测定;SDS电泳后的样品活性恢复;样品活性恢复方法;8.3.2 载体两性电解质pH梯度等电聚焦;工作原理;载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理;常规PAGE和等电聚焦电泳的区别;载体两性电解质和pH梯度的形成;用于等电聚焦的主要载体两性电解质;Servalyte (德国Serva 公司) 产品Biolyte;Pharmalyte (瑞典Pharmacia 公司) 产品分为九种pH范围;pH梯度的形成;其次，一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到0才停止。同样的，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个pH梯度。;载体两性电解质在电场中形成pH梯度的模式图;8.3.3 水平等电聚焦电泳;等电聚焦的主要应用;8.3.4 双相电泳;;;8.3.5 二维电泳;8.3.6 毛细管电泳