生物技术制药——第五章 植物细胞工程PPT.ppt

加倍单倍体技术及其应用。加倍单倍体技术(Double haploid Technology)是指利用植物组织培养技术培养单倍体植物材料(花药、花粉、未受精的子房和胚珠)获得单倍体植物,然后通过自然或人工加倍的方法获得双倍体植株的技术,其中以花药和花粉培养应用最为广泛。 利用加倍单倍体技术进行花药和花粉培养,已在250多种植物上获得成功,中国、加拿大、澳大利亚、欧盟等在花培育种中取得了突出的研究成果。我国在花药培养和单倍体育种方面总体上处于世界前列,由朱自清等研制的N6培养基广泛应用于禾本科植物的花药和花粉培养,已成为国内外花培的通用培养基。 利用花培技术,我国在水稻、小麦、油菜、大麦、甜椒等作物上培养了许多新品种,中花系列水稻品种、京花系列小麦、华油一号油菜等一大批育成品种的推广,取得了较好的社会效益和经济效益。利用花培技术获得染色体代换系、附加系,已应用于小麦、大麦以及一些茄科植物的遗传改良,大大提高了远缘杂交育种的效率。 翻译水平的检测：ELISA，Western 选择标记基因检测法： 抗生素抗性基因 除草剂抗性基因 报告基因检测法： 冠瘿碱基因 Gus基因(β-葡糖苷酸酶基因) Cat(氯霉素乙酰转移酶基因) (GFP)绿色荧光蛋白基因 Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因） 在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点： ①在一定条件下与X-G1ucuionic acid底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。 ②当加入4-甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成4-甲基伞形酮，发荧光（λ=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。 三、转基因植物生产药用植物的安全性问题 1.安全性问题 转基因植物存在的用于选择性标记的抗生素，以及导入植物的DNA序列在加工过程中可能出现的改变。 2.环境及生态问题 导入植物的目的基因是否转入其他植物，是否会破坏生态平衡。 第七节 转基因植物在制药工业上的应用 一、生产天然药物 (1)人参细胞培养 MS培养基 生长初期低糖，生长后期补糖 控制磷酸盐浓度和PH 添加生长素和激动素 离心叶轮式反应器进行 高密度培养 细胞干重最多达30g/L 人参皂苷达2g/L (2)红豆杉细胞培养 紫杉醇(Paclitaxel):二萜类化合物, 抗癌药，是有丝分裂抑制剂，可阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。 1967年美国化学家Wall和Wani首先从太平洋紫 杉（短叶红豆杉）树皮中提取出来。该药1992年底获美国FDA批准上市。 紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中， 其中树皮中的含量最高。 12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。 紫杉醇的国际市场价格为450美元/g B5培养基，补糖，暗培养 低浓度的生长激素 诱导子 培养基中加甲基戊酸，苯丙氨酸等前体 加甲瓦龙酸等中间产物 加单萜合成抑制剂 筛选细胞株 最高产量达0.15g/L (3)丹参发根生物反应器大规模培养技术 丹参(Salvia miltiorrhiza) ：活血化淤,通经止痛. 丹参中含有二类活性成分: 脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类化合物.具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠状动脉供血等药理作用,是治疗心血管系统疾病的重要药物。 丹参有效成分在原植物根中含量低、生长周期长, 加之近年产地环境污染和为防病虫喷施农药等原因, 便得原料药的供应在数量和质量上都不能满足临床应用的需要。 用植物组织培养反应器(10L规模)进行了丹参发根培养的研究, 发现丹参发根在50天内鲜重增殖倍数可高达240倍左右,丹参酮、丹酚酸A的含量也相当高，非常适合于丹参发根的生长及丹参酮的积累,而且利用此系统生产出的丹参及其有效成分由于不受农药等污染物的影响,具有广阔的市场前景。 丹参发根生物反应器培养的中试已达100L规模。 (4)紫草细胞培养 化学成分:含乙酰紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、紫草素、β，β’-二甲基丙烯酰紫草素等。 性味性寒，味甘、咸。 功能主治　凉血，活血，解毒透疹。用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。 紫草宁产生于亚洲的多年生 植物紫草的根部 。但紫草资源严重不足，在日本，紫草已濒临灭绝，在我国，紫草列入了国际二级保护植物 紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物，同时又作为高级色素使用。 紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草宁的无法满足市场需求。 化学合成紫草宁的工艺非常复杂， 且最终产率只有0.7％，生产成本昂贵。 紫草宁在国际市场上售价高达 7000美元/kg 19