第11章DNA文库的构建和目标基因的筛选PPT.ppt

第十一章 DNA文库的构建和目标基因的筛选 第一节 基因组DNA文库的构建 第二节 cDNA基因文库的构建 第三节 基因克隆的筛选策略 第四节 DNA文库的保存 基因库(gene pool)：特定生物体全基因组的集合(天然存在) 基因文库(gene library)：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库：材料来自染色体DNA，含有全部基因组序列。 任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基因组DNA是衡定的，所以用该生物的任何材料均可构建基因组DNA文库且具有一致性。 cDNA文库：材料来自mRNA，含有全部蛋白编码基因的cDNA，无启动子、终止子、内含子、基因间隔区等，序列信息量远小于基因组文库。 在高度分化的生物体中，不同器官、组织、细胞、不同发育时期以及对不同环境的应答中，mRNA种类和丰度不同，即表达谱不同，因此同种生物体的cDNA文库随表达谱变化而变化，用什么材料构建什么样的cDNA文库依研究目标而定。 西南大学 生物技术专业 基因工程 * 第一节 基因组DNA文库的构建 一、基因组DNA文库的类型和发展 1、质粒文库：容纳片段小于15kb，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。 2、噬菌体文库：一般用λ载体，插入型容纳片段小于7kb，适合于构建cDNA文库，置换型容纳9-25kb，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。 3、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比λ文库略长，达45kb左右。 4、人工染色体文库：有细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)、P1人工染色体(P1 artificial chromosome, PAC)等文库，最大插入片段分别为300kb、1000kb和300kb，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱构建。 西南大学 生物技术专业 基因工程 * 5、亚基因组文库：文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、PFGC特定片段回收、特定YAC富集等方法而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。 6、基因组文库的发展：略 二、文库的代表性和随机性 代表性意味着文库要有完备性，是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )。其中：P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 。 例：人的单倍体DNA总长为3.2 x 109 bp，假如文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。 随机性既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。 基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查； 4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆； 5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。 2、基因组DNA的切割 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区； 第二，保证DNA片段大小均一。 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以提高文库质量。 3、载体和受体的选择与制备 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或柯斯质粒；对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或插入型l载体。 几种载体的最大装载量：质粒≤ 15 kb，λ-DNA ≤ 25 kb，考斯质粒≤ 45 kb，BAC ≤ 300 kb，YAC ≤ 100