第3章生物技术制药PPT.ppt

第三章 基因工程制药;第一节 概述;应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。 癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。;利用基因工程技术生产药品的优点：;利用基因工程技术生产药品的优点：;获得目的基因;3.基因工程药物生产的上游和下游;一、工程菌（或细胞）构建中重要的工具;二、下游阶段在产业化中是极其重要的;第三节 目的基因的获得;第三节 目的基因的获得;cDNA克隆示意图;1、mRNA的纯化;2、cDNA第一链的合成;3、cDNA第二链的合成;cDNA法克隆目的基因的基本战略;cDNA第二链的合成 ;cDNA第二链的合成 ;cDNA第二链的合成 ;4、cDNA克隆;4、cDNA克隆;cDNA文库;?gt10载体;?gt11载体;cDNA片段与载体的连接;5、将重组体导入宿主细胞;6、cDNA文库的鉴定;7、目的cDNA克隆的分离和鉴定;;二、化学合成法;化学合成法的基本战略;化学合成法的基本战略;化学合成法的基本战略;第四节 基因表达;一、宿主细胞的选择;;（1）、原核细胞-1;表达的特点：;（1）、原核细胞-2;（1）、原核细胞-3;（2）、真核细胞-1;（2）、真核细胞-2;(2)、真核细胞-3;二、大肠杆菌中的基因表达;表达载体必须具备的条件;表达载体必须具备的条件;表达载体必须具备的条件;2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式;3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式;三、酵母中的基因表达;1、载体——（1）载体的复制序列;1、载体——（1）载体的复制序列;1、载体——（1）载体的复制序列;1、载体——（2）克隆载体;1、载体——（3）表达载体;2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素;（2）外源基因的表达效率—启动子;常用启动子有组成型和诱导型启动子;分泌信号的效率：分泌信号是酵母菌表达蛋白的起始分泌、糖基化和蛋白折叠加工等不可缺少的因素。 终止序列的影响：终止序列保证产物（mRNA）在适当部位终止和加上polyA尾部，这样形成的mRNA可能比较稳定并被有效地翻译。;（3）外源蛋白的糖基化;（4）宿主菌株的影响;四、动物中的基因表达;第五节 基因工程菌的稳定性;质粒稳定性的分析方法;二、提高质粒稳定性的方法;;第六节 基因工程菌发酵;菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图 ;一、基因工程菌的培养方式;;;1.3 半连续培养;1.4 连续培养 ;1.5 透析培养 ;1.6 固定化培养;二、基因工程菌的发酵工艺; ⒈培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。 无机盐、维生素等。;;;⒉接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。; 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 ;⒊ 温度的影响;适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。;⒋ 溶解氧的影响; 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 ;⒌ 诱导时机的影响;在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109/个为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。;⒍ pH的影响;Date;第八节 基因工程药物的分离纯化;一、建立分离纯化工艺的根据;二、分离纯化的基本过程;三、分离纯化的技术;四、选择分离纯化方法的依据;第九节 基因工程药物的质量控制;第十节 基因工程药物制造示例杆状病毒表达系统制药