第7章亲和层析PPT.ppt

第七章 亲和层析法;亲和作用的机理;影响亲和作用的因素; 1910年最早利用亲和纯化原理分离蛋白质(不溶性淀粉吸附淀粉酶)。 20世纪50年代有意识的利用。 1967年亲和纯化技术从理论走向实用(BrCN活化法修饰糖类载体用以偶联伯胺类化合物)。 80年代以后，生物亲和作用和其它分离技术的结合。 亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多酶类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。 ;亲和层析的基本特点;;第二节 操作;　　　sepharose 4B 具有层析速度较快，化学稳定性好，非特异吸附少，微球孔径适度，蛋白载量大的特点，并且有大量可供活化的羟基，是亲合层析的理想介质。;二、配体的选择;;;; 根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。 ; 通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。 ;亲和吸附介质的配基 ; 例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白（ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸??这些抑制剂均可作为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约为4×104L/mol（25℃）。 ; （2）抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。 但是单抗或者利用动物免疫实验从动物腹水中获得，或者通过动物细胞培养获得，是一种昂贵的生物活性物质，很难大规模使用。不过，对于产量较小的基因工程药物如组织纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA）、干扰素（interferon）等的分离纯化，单抗免疫亲和层析法的确是非常有效的纯化手段。利用多克隆抗体为配基时，只要选择适当的洗脱条件，也可进行目标产物的高度纯化。; （3）A蛋白 A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5％。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblin G，IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）。每个A蛋白分子上含有5个Fc片断结合部位。除IgG外，A蛋白与人IgM和人IgA也具有亲和结合作用，但结合力较弱。 A蛋白不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而且任何抗体的Fc片断的结构都非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。此外，A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。; （4）凝集素 凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(co