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第三章 基因工程制药2 ; 基因工程载体的定义 如果只有基因，而没有负责运载它的载体基因不可能发挥作用。外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞。 这种能承载体外源DNA片段（基因）并带入受体细胞的传递者称为基因工程载体。;质粒载体 噬菌体载体 病毒载体 其他载体 克隆载体 表达载体----胞内表达和分泌表达 原核细胞和真核细胞表达载体 根据载体功能分则可分为测序载体、克隆转录载体、基因调控报告载体等。;理想的载体应具备的条件： 具有自我复制能力 有适宜的限制酶切位点，最好是对多种常用的限制酶有单一切点，并且这些单一切点在易于被检测的表型基因上 具有一个或几个选择性遗传标记 分子量较小，在受体细胞内有较多的拷贝数 可携带足够长度的外源DNA片断，并能有效的转化至宿主细胞中 容易从宿主细胞中分离纯化;质粒载体; 根据质粒的拷贝数，可分为： 严紧型质粒：拷贝数1~3份 松弛型质粒：拷贝数10~60份 质粒的复制型不是绝对的，不仅受自身的制约，还同宿主的状况有关。 ? 分子量大 分子量小 接合型质粒 拷贝数少 非接合型质粒 拷贝数多 严紧型复制 松弛型复制 ?; 质粒的不亲和性;pBR 322质粒;; 对pBR 322质粒可利用插入失活法进行重组体的选择。例如用BamH I切割后插入外源DNA片段，形成AmpR、TetS，在如下的抗菌素培养平板上进行检验，即可方便的筛选出重组体DNA（红色标记的菌落） ;PUC系列质粒载体;; 多克隆位点： 由克隆实验中常用的限制酶所识别的序列组成，多数情况下这些酶切位点都是单一的，即在质粒载体的其他部位无此切点。这种人工合成的密集排列的系列克隆位点称为“多克隆位点”，也叫 “多接头”，又叫“限制酶切位点库”。;; 该编码区位于诱导型启动子Plac的下游，用IPTG（异丙基-?-D-硫代半乳糖苷）能够诱导该片段的合成。而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型?－半乳糖苷酶（缺失N端部分序列）实现互补，形成具有酶学活性的蛋白质。 Lac Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体（宿主）与带有完整的近操纵基因区段的?-半乳糖苷酶阴性的突变体（质粒）之间实现基因内互补，这种互补现象称为“?-互补”（基因内互补）。; 由?-互补而产生的Lac+细菌易于识别，它们在生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷）的存在下可形成蓝色菌落，这是由于?-半乳糖苷酶与X-gal作用形成了蓝色化合物（5-溴-4-氯-靛蓝）。 当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，不能形成有活性的?-半乳糖苷酶，因此带重组质粒的细菌形成白色菌落。而不含插入片段的PUC质粒转化到同样的宿主菌，则生成蓝色菌落。;;;pET 32a;IPTG诱导工作原理; 噬菌体载体 质粒载体可以克隆的DNA最大片段一般在10kb左右，但要构建一个基因文库，往往需要克隆更大一些的DNA片段。为此，人们将噬菌体发展成为一种载体。噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的DNA，且感染率高。; 柯斯质粒; 穿梭载体（shuttle vector）; 1）含有原核基因的复制起始序列以及筛选标记，以便 于在E. coli细胞中进行扩增和筛选； 2）含有真核基因的复制起始序列以及真核细胞筛选标记； 3）含有有效的启动子序列，保证其下游的外源基因进行有效的转录起始； 4）RNA聚合酶II所需的转录终止序列和poly (A)加入的信号序列； 5）具有合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。;Ti质粒 ;;用于动物宿主的载体;(C) 目的基因的获得; 原核生物目的基因的获得; 基因文库的筛选; 免疫反应法;; 真核生物目的基因的获得;真核生物基因的分离; DNA的化学合成法;PCR法;PCR反应工作原理; PCR（聚合酶链式反应）原理;;大规模基因组测序的几个支撑技术;Sanger 双脱氧末端终止法测序原理;DNA自动测序仪的发展; (D) 目的基因导入受体细胞;受体细胞; 重组DNA分子导入受体细胞; (E)重组体的筛选