第七节 放射免疫分析技术0PPT.ppt

第五节、放射免疫测定法(Radioimmunoassay, RIA) 一、基本概念 放射免疫测定（RAI）：根据抗原抗体特异性结合的原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。 同位素（isotope）：元素周期表中处于相同位置的某种元素所包含的若干种核素。 放射性核素（radionuclide）：由于核内中子数和质子数的比例不适而自发地发生核衰变，在衰变过程中将放射出一种或几种射线而转变为别种核素的不稳定核素。 1959年 Yalow和Berson建立放射免疫测定（RIA） 1960年 竞争性蛋白结合分析（CPBA） 1968年 Miles和Hales建立免疫放射量度分析（IRMA） 1968年 放射受体分析法(RRA) 1971年 Addison和Hales建立双位点或夹心IRMA RIA方法学研究进展 基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的待检抗原（Ag）同时与限量的特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑制反应，通过测定结合（ *Ag-Ab ）的或游离（ *Ag ）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。 RAI属超微量分析技术，常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。 二、RIA原理 Ag *Ag Ab Bound Free B F B/F 1 0.50 0.50 0.67 0.33 2 0.5 0.33 0.67 0.2 0.17 0.83 竞争放射分析原理示意图 125I的优点 29种同位素，125I最为常用； 半衰期适中(60天)，易于商品化和储存，也利于废物处理； 发射低能35kV γ线易于测量，井型闪烁效率高； 不发射β粒子，标记物自分解速度低； 标记过程中，标记物免疫损伤小； 化学性质活泼，标记Ag和Ab容易，可得到多种标记物而广泛应用。 放射性核素标记物制备的主要方法 氯胺T法 活化NaI中放射性碘离子 乳过氧化酶法 催化过氧气化氢释放新生态氧，使125I离子活化 双酶标记法 葡萄糖氧化酶提供过氧化氢作为乳过氧化酶底物 氯甘脲标记法 活化NaI中放射性碘离子 放射性同位素标记化合物的纯化方法 凝胶过滤法 分离标记蛋白与无机碘 离子交换法 用于分离纯化短肽标记物 透析法 将标记蛋白与小分子化合物很好地分离 电泳法 分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质 亲和层析法 利用特异抗体或受体结合分离、纯化标记蛋白质 高效液相层析法 分离效果好、快速 ConA吸附法 分离标记糖蛋白 二、RIA操作程序 配制已知浓度系列标准抗原（Ag） 加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育 加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育 分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F） 用γ计数器测量放射性计数 根据标准曲线或计算机直接算出 5.测量 4.去上清分离 立即 1.加样 1.样品或标准品 2.标记物 3.抗血清 混匀 温浴 2.加分离剂 分离剂 混匀 3.离心 动态平衡体系中: *Ag与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力 *Ag和Ab的量恒定 Ag+*Ag的分子数大于抗体的分子数 *Ag与Ag相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育 沉淀法 加涂有右旋糖酐的活性碳（DCC）吸附小分子F，离心 吸附法 调pH值于γ球蛋白等电点，加入适当浓度PEG或中性盐 过滤法 小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤膜而分离 双抗体法 固相法 SPA法 入第二抗体，形成第二抗体复合物，离心 抗体或抗原固相化，免疫反应在固相载体上完成后洗涤 金黄色葡萄球菌A蛋白促使AgAb较快速度沉淀 结合抗原(B)与游离抗原(F)分离方法 三、RIA法标准曲线 标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。这种曲线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的特定函数关系，也称为剂量反应曲线。 标准曲线的手工绘制形态 标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同，或所采用坐 标系统不同而有不同的形态。 标准曲线的基本数学函数式 放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是双向性的，服从质量作用定律。 75 50 30 10 0 1 10 100 1000 未标记抗原浓度（ng/ml) 结合/未结合的放射活性（%） 待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系 R