第五章 原生质体培养PPT.pptVIP

原生质体培养成功的首要条件是获得大量、完整、有活力的原生质体。 三、原生质体活力测定 形态识别 相差显微镜法 酚藏花红染色法 伊凡蓝染色法 FDA测原生质体活力的原理 四、 影响原生质体数量和活力的因素 1. 供试材料 2. 酶的种类、组合和酶解时间 3. 渗透压稳定剂 4. 质膜稳定剂 5. PH 6. 光照和温度 1.供试材料 虽然已能从各种植物组织和细胞中获得完整的原生质体，但植物种类、所选材料的生理和发育状态、供试材料的生长条件等因素均对分离出的原生质体数量和活力有很大影响。下列材料是较理想的分离原生质体的供试材料。 ① 自然生长的幼嫩叶片 这类材料取材方便，来源广泛，在适宜处理条件下，可以获得大量活性较高的原生质体。 ② 无菌实生苗子叶和下胚轴 种子易于灭菌，可以在短期内获得大量的供试无菌苗。子叶和下胚轴细胞年幼，具有较强的分裂和成苗能力，能产生较多的具高分生能力的原生质体。 ③ 外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培养物 这些材料不受外界环境的影响，试验重复性好，产生的原生质体产量、活性和稳定性等比较理想。 ④ 花粉细胞 花粉原生质体具有单倍体和原生质体的双重优点，花粉具有群体数量大、一致性好和取材方便等优点，是细胞工程中一种特殊的试验体系。 2. 酶的种类、组合和酶解时间 不同植物种类、组织和细胞由于细胞壁结构、组成不同，分解细胞壁所需酶的种类、浓度、组合及酶解时间也不同。 3.酶液渗透压 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外平衡，防止细胞吸水涨破和脱水邹缩（破坏内部结构）。 糖醇系统 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。但有的植物分离原生质体又是蔗糖的效果最好。 第五章 原生质体培养 原生质体培养的概念和意义 植物原生质体分离 植物原生质体培养 第一节 原生质体培养的概念及意义 一、 概念： 原生质体的概念 原生质体培养的概念 原生质体（Protoplast） 1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 植物原生质体培养的概念 指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。 二、 原生质体培养发展简史及其意义 1. 发展简史 1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体； 1960年： 英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体； 1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等； 2 原生质体培养的意义 植物原生质体细胞结构具有特殊性，是用途广泛的实验系统，其意义如下： 单细胞无性系的建立 遗传转化的良好受体 多种基础研究的实验体系 体细胞杂种的形成 第二节 植物原生质体分离 细胞壁是植物细胞的“围墙”，主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。细胞壁用其相对坚固的结构包围着其内部的原生质体，保护和支撑着植物细胞。 第二节 植物原生质体分离 一、分离方法 机械法：利刃机械切割 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理 1. 机械分离法 Klercker将材料置于高渗糖溶液中预处理，使其发生质壁分离，当原生质体收缩成球状时，用利刀切割或机械磨损组织，伤口处可以释放处完整的原生质体。 将材料置于高渗糖溶液 发生质壁分离 利刀切割或机械磨损 从伤口处释放原生质体 2. 酶 解 法 原生质体的酶解分离法指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。 2. 酶 解 法 自然生长材料的幼嫩叶片 无菌实生苗子叶和下胚轴 外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培养物 花粉细胞 ①材 料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分，其中，叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中鉴定。或者是花瓣分离原生质体，也因其有各种颜色而便于在融合中鉴定。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分离,因此常采用悬浮细胞作为分离