第六章 载体PPT.ppt

Cloning Vectors;二、基因工程的基本程序;第六章?????? 分子克隆常用的载体;第一节??????? 质粒载体;一、质粒的基本特性; 质粒的存在形式：呈共价闭合环状 ①超螺旋的SC构型 （cccDNA） ②松弛开环的OC型 （ocDNA） ③松弛线性的L构型（cDNA） 基本步骤： 细菌生长和质粒的扩增 菌体收获和溶菌 质粒纯化;氯化铯浮密度分离法; 碱变性法抽提质粒DNA;三、质粒载体的选择;四、大肠杆菌质粒载体;五、多种功能的衍生质粒的组建 ;带有不同种类抗性基因的质粒载体;pAT153是由pBR322质粒改造而成，这种质粒的拷贝数比pBR322高1.5～3倍。它的大小是3.6kb,选择标记有氨苄青霉素抗性基因Ampr和四环素抗性基因Tetr、单一切点的限制性内切核酸酶有PvuⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、ScaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ。;正选择质粒;第二节??????? 噬菌体载体;烈性噬菌体 温和噬菌体 溶源化细菌 溶源化 原噬菌体;二、λ噬菌体载体;（二）λ噬菌体的类型 插入型载体 替换型载体 ( 三 ) λ噬菌体载体的应用 1.转染作用 转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。 转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。 转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。 2. λ DNA的体外包装 ;（四） 常用λ噬菌体 凯伦噬菌体载体 这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。 Charon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。 Charon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。;三、粘性质粒;在酵母细胞中常用的载体的共同特点;第三节??????? 真核细胞的克隆载体;整合型载体（YIP）;复制型载体（YRP）;附加体型载体（YEP）;载 体 载体（Vector）：能携带外源基因导入受 体细胞，这种运载工具称载体。 1.克隆载体: 具组装、复制、扩增功能。如：pBR322、pUC18/19等。 2.表达载体: 不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如：pBV220、pKK223-3 3.载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（COS、M13）、动物病毒。 ;共同特征： ①自主复制 ②易于扩增分离纯化 ③有非必需区 ④有单一酶切位点（多克隆位点） 单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点 多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点 ⑤有选择标记基因 ⑥表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列） ;质粒;种类： F质粒：使宿主染色体上的基因通过性菌毛随其一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。 R质粒：抗性因子，携有一种或多种抗生素抗性基因转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。 Col质粒：有编码大肠杆菌素基因;质粒的类型和特性;特性： CopA和CopB基因 1.复制： 负调控 RI质粒：repA基因表达 复制 PSC101 ：正调控 是由ori复制子向左单向复制 2.不相容性；在同一细胞中，同类质粒不能并存的现象。PUC18 PUC19 分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行，质粒分配到子细胞中。 ;Triton和PEG化学提取法;煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA ;多功能质粒-PUC质粒;插入型载体 ;替换型载体;单链DNA噬菌体载体;三、动物细胞基因克隆的载体;SV40病毒 ;(1)取代型重组病毒载体 ;(2)重组的病毒-质粒载体 ;①晚期区段取代载体 ;②早期区段取代载体 ;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;