第四章 动物干细胞PPT.ppt

第四章 动物干细胞;形态特征：圆形或椭圆形，体积小，核质比大； 生化特征：较高的端粒酶活性；一般都有独特的表 面标志； 增殖特征: 自稳定性：单细胞或无脊椎动物——不对称分裂 哺乳动物——种群意义上的不对称分裂 分化特征：是干细胞最重要的特征。干细胞本生不 是终末分化细胞，具有再分化的潜力。;;二、分类 一）根据发生来源分类 胚胎干细胞： 成体干细胞：;ESC;;生殖嵴与PGC（原始生殖细胞）;;成体干细胞：神经干细胞;;;第二节 胚胎干细胞;二、胚胎干细胞的建系;1. 培养体系的选择和准备;;LIF抑止胚胎干细胞分化的信号通路;2. 胚胎的采集 一般囊胚期胚胎或后桑葚胚。 3. ICM的获取 1）直接分离法：囊胚于饲养层上自行发育成孵化囊胚，待ICM扩大增殖时挑取。或使用链霉蛋白酶处理ZP，获得裸胚培养。 2）免疫分离法：链霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次转移至补体灭活和未灭活的抗血清中，去除滋胚层细胞后，吸取ICM，移至饲养层培养。;4. ICM的离散 胰蛋白酶消化即可离散ICM。 5. 胚胎干细胞建系 ;三、胚胎干细胞的应用;;第三节、胚胎干细胞的生物学特性与鉴定方法;形态特征 体积小、核大，有一个或多个核仁； 胚胎干细胞克隆紧密堆积，细胞之间无明显的界限，细胞克隆有一定形状规律。 生化特征 具有碱性磷酸酶和端粒酶活性； 表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等表面标志； 表达OCT-4蛋白；;;人胚胎干细胞的表面标志;Otc4基因;二、胚胎干细胞的鉴定方法;3. ESC特异性表面抗原表达的鉴定： 小鼠ESC以SSEA-1为主，人以SSEA-3、SSEA-4为主。此外，ALP、Otc-4等都可作为表面标志。 4. 端粒酶活性鉴定： 端粒长度及端粒酶活性检测。 5. 体内外分化能力鉴定：体内外分化能力鉴定：胚胎小体（EB，或称拟胚体）;改变细胞的培养条件: 改变细胞的培养条件是ES细胞定向分化的基本策略,常用的方法有:与辅助细胞共培养;在半固体培养基中原位生长分化;添加生长因子、化学诱导剂等。 导入外源性基因,使其分化为某一特定类型的细胞。 体内定向分化,使ES 细胞多数分化为该组织特异性的细胞。;胚胎干细胞的诱导分化： ???牛血清，骨髓基质细胞共培养 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?造血细胞 　RA 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?神经细胞 DMSO 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?肌肉细胞 TGF-B1, VEGF, bFGF 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?血管和内皮细胞 RA+胰岛素+T3 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?脂肪细胞 BMP-2, BMP-4 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?软骨细胞 　地塞米松，磷酸甘油 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?骨细胞 基因转染 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?胰岛素分泌细胞;;人胚胎干细胞注射至免疫缺陷小鼠的后腿肌肉中形成的各种组织： （a）肠样结构；(b)神经上皮花结；(c）骨骼；(d)软骨 ；(e)横纹肌；(f)肾。 ;A.小鼠成纤维饲养细胞上培养8天后的ICM（标尺＝100um） B.ICM中分离出的H9细胞系（标尺＝100um） C. H9细胞系（标尺＝50um） D.在无小鼠胚胎成纤维细胞，但有LIF（20ng/ml）的条件下培养5d后，H9细胞发生分化（标尺＝100um） ;第四节、成体干细胞;造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。 造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。 与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。;造血干细胞的来源;二、成体干细胞的分离与鉴定（以HSC为例） 无菌采集骨髓 低渗处理 密度梯度离 心 获单核细胞 CD34抗体标记 流式细胞仪分离结合免疫吸附分离 鉴定。;Culturing Hematopoietic Stem Cell;造血干细胞的体外培养;如造血干细胞的鉴定：;造血干