分子生物学-DNA提取与检测.docVIP

DNA提取和检测 实验准备工作： 1??所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。 2??试剂配制： 1 M?Tris-HCl (pH 8.0):?称取Tris-Base?121g,?加入约800 ml?水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml.?灭菌后于室温保存。 0.5 M?EDTA (pH 8.0):?称取EDTA-Na2盐?187 g?加入约?800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可,?灭菌后于室温保存。 5.0 M?NaCl:?称取NaCl?300 g,?加入蒸馏水约800 ml?于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止2~3分钟，倒出上清液，再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml.,?灭菌后于室温保存。 酚：氯仿：异戍醇（25：24：1）的配制：可参考《分子克隆》亦可按如下方法配制取重蒸酚100 ml?，蒸馏水50 ml，8-羟基喹咛0.05g?加入500 ml玻璃烧杯于磁力搅拌器上边加热边搅拌，待酚达到水饱和后加入18 g?Tris-Base，等Tris-Base?完全溶解后加入100 ml氯仿：异戌醇（24：1），搅拌10~20分钟，静止约10分钟，除去上层水相后，装入棕色瓶，最后加入20 ml?0.1M的Tris-HCl保护液于4℃保存。 DNA Buffer的配制： 1 M?Tris-HCl (pH 8.0) 100 ml 0.5 M?EDTA (pH 8.0): 100 ml 5.0 M?NaCl: 300 ml H2O 500 ml 灭菌后于室温下保存3个月左右，用时按1.5%往Buffer中加入CTAB，在电炉上烧开；在通风橱里加入1%的巯基乙醇(?现配现用)。 ? DNA的提取： 1???取2~5 g叶片或愈伤组织，加入适量液氮研碎，转入预冷的50ml离心管，加入20 ml DNA提取缓冲液充分摇匀，于65℃水浴60~90 min，中途轻轻摇匀两次。 2???加入15 ml?氯仿：异戍醇（24：1）轻轻摇匀10分钟，于BECKMAN离心机中4000 rpm离心15分钟。 3???取上清液于另一50 ml离心管加入10 ml?氯仿：异戍醇（24：1）重复步骤2。 4???吸上清液于一干净的50 ml?离心管，加入15 ml?冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入5 ml 76%的乙醇（含10 mM NH4Ac）浸泡5 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。 5???弃乙醇风干沉淀约半小时，加入3.0 ml TE缓冲液（10 mM?Tris-HCl pH 8.0；1 mM?EDTA?, pH 8.0），20?μl RNase A（10 mg/ml），37℃温浴过夜。 6???溶液转入一10 ml离心管，加入3.0 ml苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）充分颠倒混匀，4000 rpm离心15 min，吸上清液于另一10 ml的离心管中，（可重复一次）。 7???加入1 ml?5.0 M的NaCl和3.0 ml水饱和乙醚，充分混匀，4000 rpm离心5 min。 8???弃乙醚，用20 μl枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，让下清液从缝中流入另一10 ml离心管。 9???加入5 ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入3 ml 70%的乙醇浸泡4~6 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。风干乙醇，加入500?μl TE溶解，或浸在乙醇中长期保存。 DNA检测 1?????????取DNA原液15 μl稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、?260 nm及280 nm的吸光值。 高质量的DNA要求：A260/A2302.0；?1.7A260/A2801.9 2???将DNA原液适当稀释后，用1?Χ?TAE，0.8%琼脂糖凝胶2V/cm电泳1 h进行质量检测。 3???向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR?I至4-5U/μg DNA，37℃消化过夜，用0.5?Χ?TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。 CTAB法微量提取DNA 1.?药品的配制: ??CTAB提取液： (1)100mM?Tris-HCl(PH 8.0),1.5M?NaCl,50mM?EDTA(PH 8.0) (2)1% PVP,2% CTAB (3)取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量,65℃水浴充分溶解备用。使用前要在