实时荧光定量PCR介绍.ppt

实时荧光定量PCR介绍 * * ? Real Time PCR引物设计 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。 Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 = 对引物设计要求严格 普通PCR引物 Real Time PCR引物 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值 ★ ★ ★ Tm值 40-60%(最好45-55%) ★ GC含量 Primer长度 80-150 bp(尽量限制在300 bp以内) ★ 扩增片段大小 ★ 17-25 base 使用BLAST检索，确认引物特异性 ★ ★ ★ 特异性 △ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 △ 引物3’ 末端避免2 base以上的互补序列 ★ ★ ★ 互补性 3’ 末端序列 △ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端) △ 避免T/C连续，A/G连续 ★ 序列 ★ △ 3’ 末端避免GC rich或AT rich △ 3’ 末端碱基最好为G 或C △ 3’ 末端碱基尽量避免为T 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增 ★ ★ ★ RT-PCR用引物 Real Time PCR引物设计原则 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 探针的Tm比引物高8-10℃ ★ ★ ★ Tm值 20-24 bp ★ ★ Probe长度 探针5’ 末端的第一个碱基不能是G ★ 5’ 末端序列 △ 目的序列GC含量相对较高的区域设计 △ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich (特别是3’ 端)；避免T/C 连续，A/C连续 ★ 序列 Probe内部或Probe与两条引物之间避免3 base以上的互补序列 ★ ★ ★ 互补性 BLAST检索确认Probe特异性 ★ ★ ★ 特异性 Real Time PCR用TaqMan探针设计原则 Real Time PCR探针设计原则 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 线性关系、扩增效率确认 检测灵敏度确认 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2 35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。 No Template Control确认 30Cycles内无引物二聚体产生。 相关系数（r2）：大于0.98 反应性能确认 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 主 要 内 容 3 Real Time PCR解析方法 1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 标准曲线制作 扩增曲线 标准曲线 标准品梯度的选择：5～6个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10 105 104 103 102 101 100 105 104 103 102 101 100 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 标准品的种类 基因组DNA 质粒 Total RNA cDNA 体外转录RNA DNA样品定量标准品 RNA样品定量标准品 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 质粒标准品构建流程 基因组DNA PCR 目的基因克隆 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 体外转录RNA标准品构建流程 RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。 T7 RNA polymerase 体外转录RNA Total RNA PCR cDNA RT T7 Promoter TTTT???T PCR产物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA???A AAAA???A 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 理想的标准品扩增曲线 基线平整 Negative Control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽 实时荧光定量PCR介绍 * * ? 理想的标准曲线 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。 扩增效率 相关系数 扩增效率（E）计算方法 标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时