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现代生化技术 生化技术的定义：在生物化学及其相关学科应用的各种技术统称为生化技术 研究内容：生物体的组成成分特别是生物大分子的制备、分离、检测及改造 在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题 生物大分子的分离、纯化与制备是研究其结构与功能的前题 第一章 提取与沉淀分离技术 生物大分子是指在生物体内存在的具有特殊生物学功能的高分子化合物，主要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。 细胞破碎（P3） 定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜 目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。 细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度 一、机械破碎方法 通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。 高速组织捣碎机 手提式匀浆器 研磨器 物理破碎方法 通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎方法。 物理破碎方法多用于微生物细胞的破碎。 温度差破碎法：把待破碎的样品通过温度的反复变化而使细胞破碎。 压力差破碎法：通过压力的变化，使细胞内与细胞外所受的压力不同，而使细胞破碎。 超声波破碎法：通过超声波的作用，使细胞结构解体，而使细胞破碎。 化学破碎方法 化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。 常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。 十二烷基硫酸钠：SDS 酶学破碎方法 酶学破碎方法：通过外加的或细胞本身存在的酶的作用使细胞破碎的方法。 分为：外加酶制剂和自溶法。 第二节 提取(P6) 要求： 掌握提取、盐溶、盐析、等电点的概念 掌握提取的方法 理解影响提取的因素 了解RNA和DNA的苯酚水溶液提取 P6 提取的概念：在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程。也叫抽提。 有机溶剂的提取（P8） 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等。 物质溶解度的特点（P6） 相似相容原理 酸性物质易溶于碱性物质，碱性物质易溶于酸性物质。 温度升高，溶解度一般增大。 两性电解质在等电点时，溶解度最小。 增加扩散速度的途径（P8） 增加温度 降低溶液粘度 增加扩散面积 减少扩散距离 增大浓度差 pH值（P9） 等电点：在某一个特定的pH值条件下，分子上所带的正、负电荷相等，净电荷为零，此时的pH值即为该分子的等电点。 蛋白质在等电点下溶解度最小 提取条件的选择依据 目的产物（生物大分子）溶解度的增加 保持生物大分子的生物活性。 蛋白质和酶的提取 先根据蛋白质和酶在生物体中的存在部位，决定是否进行细胞破碎。 再根据目的蛋白质和酶的结构及溶解性选择适当的溶剂进行提取 第三节 沉淀分离（P9） 要求： 掌握盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法的沉淀原理及操作注意事项 了解复合沉淀法、金属盐沉淀法及选择性变性沉淀法的沉淀原理 沉淀分离的定义（P9） 沉淀分离的定义：通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离。 一、盐析沉淀法 （P10）1. 盐析原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。 反离子作用改变了蛋白质分子表面的电荷。 离子的存在使蛋白质的水化膜改变。 （P11）2. 盐的选择 蛋白质和酶的盐析通常采用中性盐。 其中在实际中应用最广的是硫酸铵（因为硫酸铵有温度系数小而溶解度大的优点，并且硫酸铵分段盐析效果比其它盐好，不易引起蛋白质变性。） （P13）盐析时的注意事项 所添加的硫酸铵的纯度要高。并要使其充分溶解。 在同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。 盐析操作一般可在室温下进行，而某些对热特别敏感的酶，则应在低温条件下进行。 选择适当的蛋白质浓度，避免共沉淀作用。 沉淀要脱盐纯化。 二、等电点沉淀法 沉淀原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同的等电点这一特性，将不同蛋白质进行分离。 在实际使用时等电点沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 加酸或加碱调节pH值过程中，要防止局部过酸或过碱。 三、 有机溶剂沉淀法 沉淀原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离。 优点：分辨力比盐析法好，溶剂容易除去且可回收。 缺点：易使蛋白质和酶变性 操作要点 有机溶剂：常用乙醇和丙酮 温度：低温 pH: pH调至等电点附近，提高分离效果 离子强度：加入盐（减少蛋白质变性，提高分离效果）的浓度不宜太高 四、复合沉淀 沉淀原理：在溶液中加