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**************************************** 化验技术协会第九期培训资料 （微生物检定工） **************************************** 微生物菌种的使用、保存与管理、验证 微生物菌种的使用、保存与管理是微生物检验室的一项重要工作，检验室必须保藏一批形态、生物化学、血清学特性稳定的标准对照菌株，以便用于中国药典规定的无菌检查、微生物限度检查、抗生素微生物(效价)测定及测定、评价防腐剂和抗菌剂的抗菌效果，以及确认灭菌工艺的效果、检验方法的验证、培养基的促菌生长能力(灵敏度)、样品检验时的阳性对照等许多的检测工作中。因此，菌种是微生物实验使用频率最高的对照物质，相当于在化学或者仪器分析中使用的标准品。微生物实验室对菌种的管理除了与化学标准品一致的管理要求外，还因微生物的特性有一些特殊的要求。菌种是活的微生物，在菌种的使用保藏过程中需定期传代，并防止变异；因此，菌种保藏和传代是微生物检验工作中的一项重要技术。不然的话，因菌种管理不善，将会给试验结果带来很大的差异，给生产带来重大影响。下面分述有关事项。 (一)制定菌种使用、保藏管理程序 微生物检定室应制定出本室菌种的使用、保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、使用、保管、接种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种溯源性和稳定性；防止试验用菌种因使用过程中多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。 1．做好菌种的来源登记，确保溯源性清楚 制药行业微生物检验用的标准菌株主要来自中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical Culture Collection，CMCC)的系列，或美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)系列等国际法定菌种保藏机构。此外还有来自其他保藏单位或同行相互转让的有关菌种。由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC(B)代表细菌(bacteria)，CMCC(F) 代表真菌(fungi)。每种菌种都具有固定的编号，如金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、生孢梭菌CMCC(B)64941、白色念珠菌CMCC(F)98001、大肠杆菌CMCC(B)44102、沙门菌CMCC(B)50094、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104等。无论来自何处的菌种，一定要保存好菌种溯源性的原始记录。接着就可进行下一步工作。 2．菌种的接收与复活 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干粉剂，同时随菌种附有相关资料。菌种购到实验室后，应按安瓿的数量和名称和每一支安瓿的完整性在相应的菌种接收记录上记上所购菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。将安瓿贴好标签并储存于-20℃，直到需要时使用。一般安瓿冻干品可在5年之内使用。 原始菌种使用时，首先需复活冻干菌种，按(菌种保藏中心提供的)相关资料的要求进行 复溶、培养和保存。一般包括以下几个步骤： (1)冷冻菌种的复活 清洁安瓿(可用75％的乙醇)后，用砂轮在安瓿的上部划线，将安瓿掰开。用一无菌吸管吸取1-2ml适量的液体培养基（生孢梭菌用液体硫乙醇酸盐培养基；金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌用营养肉汤；白色念珠菌、黑曲霉菌用液体真菌培养基)滴加到安瓿中，轻轻旋转安瓿使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解，再将安瓿内的菌液转移至相应的培养基试管中，根据菌种类型将其放入适宜的培养条件(细菌培养温度32.5℃±2.5℃，18-24h；真菌培养温度25.5℃±2.5℃，3-5d)下培养，观察培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活生长(如不浑浊，细菌应延长培养时间至7d天以上，真菌应延长培养时间至14d以上，仍不浑浊，按相关规定灭菌处理，并且丢弃之前应灭菌处理并详细记录)。在应用前，还应确认菌种的纯度和特性。 (2)菌种确认 用无菌接种环取上述培养物，在相应的培养基平板(营养琼脂、大豆胰蛋白胨琼脂)上或相应的细菌鉴别平板(如伊红亚甲蓝、麦康凯、十六烷基三甲胺、甘露醇高盐)上划线分离单个菌落，置适宜条件下培养(若该类微生物为厌养菌，则培养条件应为厌养条件)。以同样方法取真菌和酵母菌培养物至SDA(萨布罗培养基)平板上或玫瑰红钠培养基平板上，23-28℃下培养7d；培养后观察是否具有典型的菌落状态，然后挑取单一的纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特征及菌体形态，并进一步做生化鉴定实验以确定菌种。也可使用API鉴定系统做鉴定。对已鉴定确认的菌种进行菌种传代和保藏。 (3)污染处理 假如在该平板上发现有其他菌落生