流式细胞术在出血与血栓性疾病中的应用课件.ppt

流式细胞术（flow cytometer，FCM）在出血与血栓性疾病中的应用 安徽省立医院血液科 吴竞生  FCM在出血与血栓性疾病中的应用 集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学 及单克隆抗体为一体的新技术。 对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速、 灵敏、多参数定量分析和分选技术。 开创了对单个BPC或亚群分析的新途径。 FCM分析BPC的主要项目 血小板计数：CD41、CD61射门 网织血小板（RNA噻唑橙黄染料）：含RNA的BPC 自身抗体:特异性血小板抗体、PAIg、同种抗体 免疫表型分析：膜糖蛋白表达: GPIb/IX/V复合物(CD42a、CD42b、CD42c、CD42d)) GPIIb/IIIa复合物（CD41、CD61）FV、IIIa BPC活化：膜糖蛋白表达（P-选择素，CD62p） BPC内物质，微粒对不同刺激剂的反应性：胞质钙流 FCM在出血性疾病中的应用 1、血小板减少：血小板数量、网织血小板 2、血小板功能缺陷 血小板无力症： GPIIb-IIIa（CD41- CD61） 巨大血小板综合征： GPIb-IX（CD42b-D42a 3、血小板抗体： 血小板相关免疫球蛋白（PAIg） 血小板糖蛋白特异性自身抗体（GP） 4 、血小板采集、储存与输注的监测. 血小板计数 BPC直径1-4?m，与RBC，WBC或碎片、免疫复合物大小相等， 影响计数准确性。 FCM优点： 利用各种BPC特异性单克隆抗体→直接标记荧光素分子 快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差5% ， 尤其适合BPC＜20X109/L 重复性好 缺点：技术条件要求高，费用高。 FCM分析血小板原理 利用荧光素标记的BPC特异性单抗或与待测成分特异性结合 且能发荧光的物质 + 分离BPC或全血 →去除未反应的单抗或荧光物质; →特异检测5000-10000 BPC光散射与荧光信号（单色或多色）; →获取, 统计数据, 分析, →根据光散射与荧光强弱 →计算阳性BPC百分比或所测成分的含量（GP/BPC). FCM分析血小板方法 抗凝血2ul? 调节BPC 105-106/ml ? 2-80C 预冷的1% 多聚甲醛1ml固定，2h ? BPC特异单抗+荧光剂(异硫氰酸荧光素)(CD42b FITC) ? +SSC+FSC设门-特异性选择BPC. ? 检测10000-100000 BPC表面荧光信号. FCM获取，分析数据 结果表示: 平均颗粒荧光强度-活化时GP:Ag量 特异性荧光抗体结合阳性BPC% -x. 血小板光散射图 FCM分析血小板的客观评价 利用各种BPC特异性单克隆抗体→直接标记荧光素分子 优点： 1、接近生理条件直接测定血小板: 2、微量（2ul) 3、快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差5%，主观因素少 灵敏度高、尤其适合BPC＜20X109/L、重复性好 4、克服BPC小；环境影响（血管壁、剪切力、刺激剂→变形、黏附、 聚集、释放、血小板活化与反应性 不足： 1、技术要求高,费用高。 2、不能反映与血管壁相互作用 ， 血小板功能缺陷 黏附异常 巨大血小板综合征 GP1b-FX 血管性血友病（vWD） vWF量、质异常 血小板型vWD GPIIb-FIX自发结合vWF 聚集异常 血小板无力症 GPIIb-IIIa缺乏 颗粒异常 灰色血小板综合症 ?颗粒储存异常或成分缺乏 储存池病 ? ?、致密体颗粒缺乏 受体与信号传递异常 环氧化酶缺乏症 环氧化酶缺乏 合成酶缺乏症 合成酶缺乏 信号传导缺陷症 花生四烯酸不能动员 膜磷脂异常 血小板膜糖蛋白分析 GP受体是血小板功能基础，分子结构或数量异常，可导致出血或血栓。 GPIIb/IIIa复合物(CD41/CD61) GP Ib/IX/V复合物(CD42a/CD42d) GPIa/IIa复