医学微生物学病毒感染检查方法与防治原则.ppt

第25章 病毒感染的检查方法与防治原则 内 容 二、检查方法 ? 病毒的形态学检查 ? 病毒的血清学检查 ? 病毒的分子生物学检查 ? 病毒的分离培养与鉴定 1. 病毒形态学检查 电子显微镜：可观察各种病毒的形态 但设备贵、操作复杂，应用受限 光学显微镜：可观察大病毒（痘病毒）和包涵体 对一般病毒检测意义不大 Electronmicrographs 2. 病毒血清学检查 2. 病毒血清学检查 (1) 中和试验(Neutralization test) (2) 血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test) (3) 补体结合试验(Complement fixation test) (4) 免疫标记法(FIA、EIA、RIA) (5) 蛋白印迹(Western blot) 3. 病毒分子生物学检查 ? 核酸电泳(nucleic acid electrophoresis) ? 核酸杂交(nucleic acid hybridization) ? 核酸扩增(PCR） ? 基因芯片(gene chip) ? 基因测序(gene sequence) 动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等 优点：结果易观察，可建立动物模型 缺点：有饲养条件要求，费用高、动物 体内常带有潜伏病毒。 目前已很少应用。 鸡胚接种部位： (3) 细胞培养 (cell culture) 根据细胞生长的方式分: ? 单层细胞培养（monolayer cell culture） ? 悬浮细胞培养（suspended cell culture） 根据细胞来源、染色体特征及传代次数分: ? 原代培养细胞 ? 二倍体细胞株 ? 传代细胞系或株 病毒鉴定： ⑴ 细胞病变效应 (cytopathic effect, CPE) 蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 原理：将适当稀释浓度的病毒液定量接种于敏感的单层细胞，经一段时间吸附后，在细胞上覆盖一层未凝固琼脂，待其凝固后继续培养，由于病毒的增值使感染的单层细胞病变脱落，形成肉眼可见的空斑，一个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的，计数平板中空斑数可计算出样品中活病毒的数量。 通常以每毫升病毒液的空斑形成单位（plaque forming unit, PFU),既 PFU/ml表示。 蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 用途： ? 测定感染性病毒量 单位: PFU (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一 个空斑称为空斑形成单位。 ? 分纯病毒 50%组织细胞感染量(50% tissue culture infectious dose, TCID50) 概念: 测定病毒感染细胞后引起50%细胞病变或 死亡的最小病毒量。 方法: 将待测病毒液作10倍系列稀释，分别接种于 单层细胞，经培养后观察CPE等指标，以能使50%细 胞感染的病毒最高稀释度作为终点。用统计方法计 算出50%组织细胞感染量。 用途: 判断病毒的感染性和毒力 Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet. ⑵ 红细胞吸附（hemadsorption, HAd） 受染细胞膜表面血凝素（HA）＋ RBC表面HA受体 ⑶ 干扰现象（interference） 风疹病毒＋人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（－） 埃可病毒＋人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（＋） ＋人胚肾细胞 风疹病毒？ 埃可病毒 CPE(-)——埃可病毒(-) 风疹病毒(+) CPE(+)——埃可病毒(+) 风疹病毒(-) ⑷ 细胞代谢的改变 病毒 感染细胞 在细胞内增值 细胞代谢减慢 培养液pH值变化减慢 4. 病毒的分离培养与鉴定 : ? 病毒的分离培养 ? 病毒的鉴定 ? 病毒数量及感染性测定 病毒数量及感染性测定： 蚀(空)斑形成试验 50%组织细胞感染量 病毒总量(活病毒+死病毒)： 感染性病毒量: 血凝试验 PLAQUE ASSAY PLAQUE ASSAY PLAQUE ASSAY Vero cells, which grew confluently on the bottom of the plastic plate (1.5 cm diam