《生化技术原理教学课件》第十章 免疫分析.ppt

（1）微量免疫电泳（micro-immunoelectrophoresis） 是将琼脂电泳与免疫扩散结合起来，用于分析抗原或抗体性质的一种方法。定性或半定量抗原。 原理 把抗原置于用缓冲液配制的琼脂板中央的孔穴内，电泳后，能使其所含组分按各自的理化性质分成不同的区带。然后再与电泳方向平行的抗体槽中加入的抗体进行扩散。当抗原与相应的抗体相遇并达到等量时，则形成沉淀弧，每一种抗原组分可形成一个沉淀弧，因此形成沉淀弧的数目就相当于抗原混合物中所含不同组分的数目。 （2）对流免疫电泳（counterimmunoelectrophoresis） 应用广泛 优点：比琼脂扩散法灵敏度高，检测样品需要的时间短。 在pH8.6缓冲液中进行电泳时，处在阳极端的抗体γ-球蛋白的电渗力大于电泳力，故向阴极移动。而处在阴极端的抗原，则向阳极移动。当抗原与相应的抗体相遇时，如果比例恰当，就会产生肉眼可见的沉淀弧或沉淀线。 灵敏度高，时间大大缩短（30-60分钟可见结果）。 条带形成的形状与抗原抗体泳动的速率、分子大小、分子构象、电荷多少等有关。 （3）火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis） 原理：当抗原在电场力的作用下通过含有抗体的琼脂凝胶时，将与相应的抗体形成沉淀弧。而未结合的抗原将继续移动至抗原抗体沉淀弧的先导部分，并溶解复合物再向前移动，直至抗原与抗体反应完毕，便可看到形状似“火箭”的沉淀峰。在抗体量一定时，沉淀峰的高度随着抗原量的增加而增加，当抗原量一定时，沉淀峰的高度随着抗体量增加而降低。利用这一关系可对抗原或抗体进行定量测定。 注意 用小电压（10-20V），避免抗原在孔内扩散 抗体的用量合适： 太低，不能形成完整的火箭峰，出现冲刷现象过高，表现为抗原量过低，抗原泳动距离短，走不出琼脂孔 3．固相免疫吸附法 是把抗原或抗体吸附在固相载体（如纤维素、硝酸纤维素纸、聚苯乙烯、琼脂糖凝胶等）上，用其检测抗体或抗原含量的一种方法。常用的有：酶联免疫吸附测定法（ELISA）  放射免疫测定法（RIA） 放射免疫测定法（radioimmunoassay） 美国女科学家 R.Yalow1950’末发明（胰岛素）1977年获诺贝尔医学奖 依据：标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与抗体（Ab）可发生竞争性抑制反应，反应形成的有限Ag*- Ab复合物与待测抗原含量的的相关性 剂量反应曲线 剂量反应曲线又称标准曲线，即用标准物浓度（Ag）对结合率[B/（B+F）]作图。在RIA中被测定物质的浓度（量）可从标准曲线上查得 标准曲线是验证方法的灵敏度、检验抗血清质量和鉴定标准品纯度的主要依据。 测定方法 RIA测定方法分三个步骤： ① 待测标本中未标记抗原，标记抗原和抗体进行竞争抑制反应； ② 将标记抗原和抗体相结合的复合物（B）和未结合的标记抗原（F）的分离（分离方法有第二抗体法、聚乙二醇沉淀法、活性炭吸附法等）； ③ 对B进行放射性强度的测定（B为标记抗原抗体复合物，F为游离标记抗原）。根据标准曲线查得待测抗原浓度。 RIA标准曲线的类型 放射免疫分析的临床应用 临床常用近 200 种 （1）肿瘤相关抗原的测定：AFP、CEA 、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA 等 （2）激素的测定：下丘脑-垂体-甲状腺轴激素，下丘脑-垂体-性腺轴激素，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等 （3）非激素蛋白质的测定：铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、III 型前胶原肽、层黏蛋白等 （4）酶的测定：前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE 等 （5）药物及维生素的测定：地高辛、叶酸、VitB12 等 （6）免疫分子的测定：各种 Ig、抗 DNA、IL、CD、CIC （7）病原学研究：现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定的价值 （8）其它：甘胆酸、透明质酸等 几种酶标分析仪 DNM-9602A酶标分析仪 DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602 标配酶标分析仪 四、抗体的检测 抗体的检测：定性与定量分析。 定性分析抗体的方法：间接血凝法、反向间接血凝法和胶乳凝集法等。 定量分析抗体的方法：放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）、扩散法和火箭免疫电泳法等。 酶联免疫吸附测定（ELISA） 1971年瑞典学者Engvail 和Perlmann，荷兰学者Van Weerman 和Schuurs 分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免