粘质沙雷氏菌脂多糖的提取课件.ppt

粘质沙雷氏菌脂多糖的提取 实验目的 1、了解脂多糖 （LPS）的生理 生化作用及其制 品的应用； 2、掌握从粘质沙 雷氏菌中提出LPS 的主要方法。 实验原理 内毒素（endotoxin，ET）是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的一类脂多糖物质。机体应用小剂量内毒素，能表达出显著的有益作用，是一种有效的保护性抗原，临床上用于各种恶性肿瘤患者用因放疗、化疗所引起的白细胞减少症，以及由白细胞减少继发的慢性乙型肝炎，多发的急慢性感染等。 脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8-10nm）的类脂多糖类物质。它是革兰氏阴性细菌所特有的结构，是革兰氏阴性细菌细胞壁的重要组成部分。它还是一种非常重要而被广泛研究的免疫增强剂，同时一些脂多糖是致病性的内毒素。另外在血清分型中脂多糖也有重要作用。 LPS及其类脂A对机体能发挥广泛的生物学作用。LPS一方面可视为革兰氏阴性菌的致病因子，因而在革兰氏阴性菌感染的发病机理中起着十分重要的作用，另一方面LPS对机体亦可表现出显著的有益作用，如抗肿瘤作用，增强机体特异性抵抗力等。所有的内毒素尽管来源不同，但均具有相似的生理作用。 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）曾称灵杆菌，它属于真细菌纲，真细菌目，肠杆菌科，沙雷氏菌属。它是细菌中最小者，细胞杆状或球状，单个存在或排列成短链，每链有3~6个细胞，能运动，有4条或更多鞭毛，周身鞭毛，无荚膜，无芽孢。 粘质沙雷氏菌为腐生菌，在自然界 中分布很广，分布于土壤、水和食 品中，也存在于人的呼吸道、肠道 和粪便中。所以该菌可自土壤、水， 人和动物的粪便中分离得到。 该菌属长期以来认为对人体无害，但近来发 现粘质沙雷氏菌是条件致病菌，可引起肺炎、 泌尿道感染、呼吸道感染、败血症以及外科 术后创伤感染，是医源性感染的重要条件致 病菌。约半数菌株能产生红色的灵菌素，多 次传代后产生色素的能力减弱，甚至消失。革兰氏染色呈阴性。 灵菌素是由粘质沙雷氏菌菌体中提取的脂多糖，能激活脑下垂体——肾上腺皮质系统，调整机体内部环境与功能，增强机体对外界环境变化的适应能力，刺激机体产生体液抗体，使白细胞总数增加，吞噬功能加强，激活机体防御系统，抗御病原微生物及病毒的侵袭。同时它还具有抗菌抑癌，提高免疫力等生理活性功能。 目前从粘质沙雷氏菌中提取脂多糖的方法有很多，主要有三氯乙酸-乙醇冷提法、盐析法、热水提取法和热酚水法。 （1）三氯乙酸-乙醇冷提法。粘质沙雷氏菌深层发酵获得的菌体，用生理盐水洗后，用0.25 M三氯乙酸浸提（1：3 v/v）0 ℃搅拌2 d，离心，菌体再用三氯乙酸浸提2次。浸提液合并通过0.5 cm高的硅藻土抽滤，得透明的乳白色液体，在3—6 ℃时加入3.3 %体积醋酸钠饱和的乙醇溶液，然后加入6—8倍体积的冷乙醇，使灵菌素沉淀，沉淀物溶在0.25 M三氯乙酸，按上法反复沉淀3次，透析、冷冻干燥的灵菌素冻干品。 （2）盐析法。粘质沙雷氏菌深层发酵获得的菌体，用生理盐水洗后，用0.2 M三氯乙酸浸提（1：3 v/v）0 ℃搅拌2天，离心，菌体再用三氯乙酸浸提2次。浸提液中加入固体硫酸铵使之呈50 %饱和度，如有沉淀离心弃去，上清液中加硫酸铵至饱和，室温放置24 h，发生沉淀[如不发生沉淀，需加入2倍体积的丙酮：乙醇：乙醚（2：2：0.25），离心分成溶剂层和水层，水层继续使用上层溶剂混合物处理2—3次，直至溶液中乳白色消失为止]。收集沉淀，溶于水中，通过强酸和强碱性离子交换树脂除盐，流出液冷冻干燥，得灵菌素冻干制品。 （3）热水提取法。菌体用PH 3.5稀醋酸溶液回流提取，提取液用Sevag法除去蛋白质，水层加乙醇，离心收集沉淀，透析，透析液中加NaCl及乙醇，离心分离沉淀得白色粉末粗制品。将它溶于水中，加乙醇（一倍体积）除去沉淀，再加一倍体积乙醇，收集沉淀，透析，冻干得粘质赛氏甘露聚糖（Serratimann）。上清液中加入NaCl离心收集沉淀，透析，脱盐，冻干得粘质赛氏杆菌素（Serratigen）。 （4）热酚水法。 本次试验所采用的方法， 相比其他三种方法，具有 操作相对简便，提取效果 好的优势。 三、仪器和药品 ⒈药品 牛肉提取物、蛋白胨、NaCl、 琼脂、蒸馏水、生理盐水、 苯酚、无水乙醇、 NaHCO3、 EDTA。 ⒉仪器 广泛pH试纸、塑料布、透析袋、。