第二章+基因工程酶学基础.ppt

本章的主讲内容（6学时，3次课） R/M体系 R/M体系组成： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶 R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解 www.// rebase数据库 四、酶切反应 要点： 连接酶的种类 特征和区别 反应机制 影响反应的因素 科学家发现细胞中线状的DNA 分子经常能够自动环化起来， 形成稳定的环状结构。而在体 外，线状的DNA分子虽然也能 够自动环化起来，如果没有任 何其它酶的作用，这种结构将 是很不稳定的，容易在加热后 重新解开成线状。1967年，世 界上有数个实验室几乎同时发 现了一种能够催化两条DNA的 末端之间形成磷酸二酯键的 酶，即DNA连接酶。 两种酶的区别？ 表2-4 1、两种酶来源不同。 2、两种酶的作用机理不同（能源辅助因子不同）。 3、DNA体外连接方式不同。 (1)、用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断。 4、作用对象不同。 T4多核苷酸激酶在DNA分子克隆中的主要用途是：①标记分子的5′-末端；②使缺失5′-P末端的DNA补上磷酸，发生磷酸化 核酸外切酶 基因操作过程中经常要针对性地降解掉DNA双链 中DNA-RNA杂种双链分子中的一条链，以满足某些特 殊的实验要求，达到特殊的实验目的。这时会经常 用到一些核酸外切酶。 　　核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始 按序催化降解核苷酸的酶。按作用的特性差异可以 将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 第四节 其它工具酶 了解一些其它酶的作用和用途 第四节 其它工具酶 P53 第四节 其它工具酶 发夹结构 第一节 限制性核酸内切酶 P46 在PH不合适，或甘油浓度过高≥10%时， 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性， 因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第二节 DNA连接酶 第二节 DNA连接酶 E.coli DNA 连接酶 DNA连接酶 是由大肠杆菌染色体编码的 T4 DNA连接酶， 是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的。 连接酶的来源 P21 （3）热稳定DNA连接酶 三 (2)、用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来. 第二节 DNA连接酶 酶-AMP复合物生成 第二节 DNA连接酶 DNA连接酶 －－NAD+ T4 DNA连接酶 －－ATP 教材P22 第二节 DNA连接酶 第二节 DNA连接酶 体系-反应程序 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA修饰酶 理解DNA修饰酶的作用 掌握DNA修饰酶的种类、特征、区分 掌握DNA修饰酶的用途 在DNA的切割与连接过程中，经适当的限制性核酸内切酶处理或机械法处理产生的DNA片段，其末端是各种各样的。相同的粘性末端容易连接，而其它类型的末端连接都比较困难，在适当的情况下必须对这些末端进行各种“修饰打扮”，才有可能被连接酶顺利地连接起来。 　 生物体内存在着各种类型的修饰酶，能为DNA或RNA分子的末端进行各种“修饰打扮”，如末端脱氧核糖核苷酸转移酶、T4多核苷酸激酶和碱性磷酸酶等等。 第三节 DNA修饰酶 第三节 DNA修饰酶 1） 碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌或小牛肠道，可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。 2） T4多核苷酸激酶： 来自于T4侵染的大肠杆菌，它能催化γ-磷酸从ATP分子上转移给DNA或者RNA的5′-OH末端，在5’端增加磷酸基团 3） 末端脱氧核苷酸转移酶：来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。 第三节 DNA修饰酶 末端转移酶，是从小牛胸腺中提取的。该酶能催化5′脱氧核糖核苷酸进行5′→3′方向的聚合作用，逐个地将脱氧核糖核