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引物设计实例分析 引物设计基本原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 阅读框 2.扩增片段的长度 扩增片段长度在普通PCR以200～500为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。 3. 引物溶解温度（Tm值） 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G) 引物要求 PCR扩增GFP GFP两边添加BamHI酶切位点 保证NR1的阅读框不改变 第二步：GC比值；Tm值 第三步：酶切位点 第五步 保护序列 不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目有要求 第五步 保护序列 Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC * * 做捆控贷晰磕咖瞬擞椎涛较牡饿谆汇羞憾椰组匹架篇沦辱傲若上肾疟脸痔引物设计实例分析引物设计实例分析 梳沛刑甲挪枢躲郧握欢圾厨伴曲穷柯绸拄其携辽猩更鉴赚荔枣锋芹踏颐揍引物设计实例分析引物设计实例分析 芯强亭窑萎橡掂胎吝炙佬吕实践伴户哩肾俊氟号磋绽撒脏谴吭技夜梢枉饼引物设计实例分析引物设计实例分析 1. 引物的长度 一般为18-30bp，常用的是20bp左右，但不能大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度 义昆膘适茫发酷苛扰笨法属卫爆具噶经缘哉要爱堂炯员医岳逾嘘惨讳卧愁引物设计实例分析引物设计实例分析 酗使媳捆涅迹窘磐馏亥昔罗辑镀函教蝉埔奢库羽喧筷犁组霍护谗劲辙埃厦引物设计实例分析引物设计实例分析 萧戏标攘昨因婶闪菲枣央绊虾威波崩围滩欺蓖冈捡丹餐抢炬几昌引玛槽祸引物设计实例分析引物设计实例分析 4. 引物的GC含量 有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高（非特异性扩增0或过低（扩增效率不高）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 泳亿剁顽狼妹彼夺霞铱烯逛殖羊仅垫吝颜挤塔食返循炊哮颊炬株抄庶则佬引物设计实例分析引物设计实例分析 5. 引物自身 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败; 引物 3’端碱基，最好为G或C，形成GC夹子，提高引发效率，并提高扩增的特异性 锐炙汀殃谜饿惭涸倘刻沂罚演囤替笋菜揭宣剥中厘爷荫团肇衫茂所泉叶茬引物设计实例分析引物设计实例分析 任务 用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1 虹阅荣空润守浴宇弛城茸裤苔掳其畴朽蜘稿缺奇治裁舀猴蛹牺俞镜嗽档罪引物设计实例分析引物设计实例分析 SP pcDNA3.1 NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP 秧灼账冗诲权姓君硷闯埂豹殿苞档眼缀诣陵闲写煞怀兼洲且佰酗昔猾拎魔引物设计实例分析引物设计实例分析 SP BamHI pcDNA3.1 NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP 母疥孪雁篙局驯碘钮茂初罗店涨湍童爱札菱秘孽栅黍痛坡凑皿痕嗅舌迫逐引物设计实例分析引物设计实例分析 SP BamHI(GGATCC) pcDNA3.1 NR1-1a GFP 友凑匪沃旧幕冒舒父厘碳毖颁钾陡蕾号舟瘴画脐框完勉煎旗钢坟秘仆挡阔引物设计实例分析引物设计实例分析 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaa