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产柠檬酸用黑曲霉选育 　　摘要：利用已有菌种进行分离复壮、斜面培养、麸曲培养，然后发酵，检测产生柠檬酸的量，选择产酸能力较高的菌种，在选出菌种的基础上重复此步骤，挑选出产酸能力最大的菌种，通过实验结果，表明第二次选育的菌种的产酸能力比第一次选育出的种子能够提高75.88％。 　　关键词：黑曲霉　薯粉　柠檬酸　菌种选育 　　 　　引言 　　 　　柠檬酸又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，有强烈的酸味，它存在于天然果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。早期柠檬酸是以天然果实为原料加工而成，1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，柠檬酸生产由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，至20世纪70年代中期，已初步形成了生产体系。 　　柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。 　　1)国内外黑曲霉菌种选育研究概况。产柠檬酸黑曲霉已经历了几十年的诱变(induced mutation)筛选，对常用的诱变处理具有一定的抗性。中科院有人尝试把离子束应用于产柠檬酸黑曲霉的诱变，并取得了一定效果。在此影响下，有人做过用低能离子束注入黑曲霉来优化菌种的产酸能力。李文玲等也曾经用Co60～γ射线诱变产柠檬酸的黑曲霉菌种，也取得了很大的成果。欧美是除中国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产企业的经济和技术实力比较雄厚，一般都是集技术开发、工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬酸行业，在技术和管理上具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。本文研究的育种方法从我国的国情出发，方法简单易学，效果显著，在目前生产分散，技术水平低的实际情况下具有一定的借鉴和推广意义。 　　2)黑曲霉(Aspergillus niger)的形态特征和生理特征。在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端生成串分生孢子。黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般pH值为3～7；产酸最适pH值为1.8～2.5。生长最适(optimum)温度为33～36℃，产酸最适温度在28～36℃，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在35°Be左右的麦芽汁培养基上。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能力用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。 　　 　　1.主要工作内容和目标 　　 　　用已有菌种进行分离复壮、种子斜面扩大培养、麸曲孢子培养和摇瓶培养，检测菌种的产酸能力，然后反复选择出产酸能力最大的菌种，最后用沙土管保存备用。目标是使经过第二次选育的菌种的产酸能力比第一次提高20％以上。 　　 　　2.研究方案 　　 　　 　　 　　3.药品和材料(见下表) 　　 　　 　　5.分析检测方法 　　 　　酸度测定：碱式滴定法 　　波美度算法：144.3 144.3/p 　　p：麦芽糖的密度 　　残留淀粉检测：碘液滴定试验 　　 　　6.菌种自然分离复壮方法 　　 　　6.1　第一次自然分离复壮 　　配制察氏培养基。将平碟、1ml吸管、冷却水、装有99m1稀释用水的250ml三角瓶、装有20ml及小玻璃珠的100ml三角瓶、接种环、察氏培养基等物品在0.11MPa高压蒸汽灭菌30分钟。在酒精灯火焰旁将培养基倒入平碟，使成薄层，放平冷却；灼烧接种环，从出发菌种斜面上取一环孢子放入盛有玻璃珠的三角瓶内，摇震5～10分钟，使孢子呈分散状态；吸取孢子悬浮液1ml，依10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释，每吸一次换一根吸管；将10-5孢子悬浮液吸取0.5ml放入平碟中，合拢平碟，左右摇动，使孢子悬浮分布均匀，待冷却后放入恒温室(35℃)培养3天后取出置于冰箱内(4℃)保存(培养时平碟底部朝上，并注明时间与菌种编号)。 　　 　　6.2　第二次自然分离复壮 　　方法采用划线分离法，好处在于它省去了稀释法的复杂步骤以及容易染菌的缺点，具体方法如图1所示。 　　 　　 　　7.菌种斜面孢子扩大培养方法 　　 　　制备麦芽汁琼脂斜面。将干麦芽磨碎，用6