6周递增负荷运动对大鼠小肠集合淋巴结细胞线粒体凋亡途径影响.docVIP

6周递增负荷运动对大鼠小肠集合淋巴结细胞线粒体凋亡途径影响 　　摘 要：研究6周递增负荷运动对小肠集合淋巴结（PP结）线粒体膜电位（ΔΨm）、BaxmRNA、Bcl-2mRNA和细胞色素C（Cyt C）的影响，探讨PP结淋巴细胞线粒体凋亡途径指标的变化。将64只8周龄雄性SD大鼠随机分为运动组和对照组，运动组进行6周的递增负荷跑台训练，分别于第0、2、4、6周末，利用FQ-RT-PCR技术测定Bax和Bcl-2mRNA的表达水平；利用JC-1染色流式细胞术检测PP结淋巴细胞的平均J-aggregate（ ）和J-monomer（ ）的含量，并计算ΔΨm（ / ）；用ELISA法测定Cyt C的浓度。结果显示：（1）6周递增负荷运动过程中，在第2、4、6周，PP结淋巴细胞的ΔΨm显著低于0周，第4周的ΔΨm最低；（2）与0周相比，第4、6周PP结BaxmRNA表达明显增加，Bcl-2mRNA表达降低，Bcl-2/Bax值明显降低；（3）与0周相比，第2、4、6周PP结Cyt C浓度明显增加。结果表明递增负荷运动可能是通过影响线粒体途径从而影响PP结淋巴细胞凋亡的。 　　关 键 词：运动生物化学；运动免疫；淋巴细胞凋亡；线粒体；膜电位；大鼠 　　中图分类号：G804.7 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2013）02-0141-04 　　小肠集合淋巴结（Peyer’s patches，PP结）是免疫应答的诱导和活化部位，其淋巴细胞最终离开PP结归巢到肠黏膜固有层，进一步分化为成熟浆细胞并分泌IgA发挥免疫效应[1]。课题组前期的研究发现，递增负荷运动会导致PP结淋巴细胞凋亡增加[2]。而长期大强度运动诱导PP结淋巴细胞凋亡及机制研究甚少，为了进一步证实递增负荷运动诱导PP结淋巴细胞的凋亡及机制，本研究着重探讨递增负荷运动过程中，PP 结淋巴细胞线粒体膜电位的变化、细胞凋亡关键分子细胞色素C（Cytochrome C，简称Cyt C）的变化及与线粒体凋亡通路密切相关的促凋亡基因BaxmRNA和抗凋亡基因Bcl-2mRNA的表达情况，递增负荷运动过程中PP结淋巴细胞的线粒体凋亡机制，为长期大强度运动诱导免疫细胞凋亡及机制研究提供依据。 　　1 研究对象与方法 　　1.1 研究对象与分组 　　SPF级雄性SD大鼠（8周龄，64只，购自广东中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK （粤）2008-0020；NO：0104976，粤监证字F2008A002）被随机分为实验组和对照组，各为32只。实验组进行6周递增强度训练，对照组，正常喂养，不进行运动干预，于第0、2、4、6周末各从实验组和对照组取8只大鼠脏器并测试相关指标（最后一次运动后48 h无菌采样）。 　　1.2 运动方案 　　采用本课题组反复实验探索的6周递增负荷模型。先采用低强度适应性运动（10 m/min）训练1周后，负荷递增至20 m/min。随后每周递增负荷增量5 m/min。至第6周，达到40 m/min。 　　1.3 测试指标与方法 　　1）线粒体膜电位测定：JC-1膜电位检测试剂盒（JC-1）购于碧云天生物技术研究所（C2006），采用FACS Calibur流式细胞仪进行检测。无菌条件下，从小肠壁上切取PP结，取200目钢网极轻柔研磨细胞，400目尼龙网过滤。收集的细胞用冷PBS离心（200 g，5 min）洗涤2次，悬浮于含100 mL/L胎牛血清RPMI-1640完全培养基中，计数并且调整细胞浓度，取5×105细胞，重悬于0.5 mL细胞培养液中，加入0. 5 mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。在37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中孵育20 min。孵育结束后，离心3 min （600 g ，4 ℃），沉淀细胞。弃上清，用JC-1 染色缓冲液洗涤2次后，再用1 mL的JC-1染色缓冲液重悬，并立即进行流式细胞仪检测。数据采用WinMDI 2.9软件进行分析处理，计数红色荧光强度平均值（ ）和绿色荧光强度平均值（ ），用红色荧光强度与绿色荧光强度的比值（ / ）代表线粒体膜电位去极化程度。 　　2）Bax、Bcl-2mRNA的测定：RNAiso Plus和SYBR? Premix Ex TaqTM反应试剂购自（TaKaRa）大连宝生物公司；引物（见表1）委托上海Invitrogen公司合成；采用全自动荧光定量PCR仪进行测定。 　　3）细胞色素C的测定：采用ELISA检测，Cyt C浓度测定严格按照检测试剂盒（RD systems）说明书要求进行。在酶标仪（Tecan Infinite F200）上，于450 nm波长读取光密度值，根据标准曲线计算出Cyt C的浓度。 　　1.4 数据的统计学处理 　　所