响应面法优化提取三角帆蚌粗多糖及分离纯化和一级结构表征的研究.docVIP

响应面法优化提取三角帆蚌粗多糖及分离纯化和一级结构表征的研究 摘要：本课题主要是对三角帆蚌多糖（HCPS）的提取、纯化和一级结构表征进行研究。首先，在单因素的基础上，采用三因素三水平Box-Behnken设计和响应面分析法优化提取三角帆蚌多糖（HCPS）。结果表明，最佳条件为：固液比为：1:8（），在此条件下，粗多糖得率为3.66%。粗HCPS通过DEAE-cellulose 52色谱和Sephadex G-100色谱分离得到三种组分：HCPS-1, HCPS-2 和HCPS-3，各自的得率分别为HCPS-1 26.91% HCPS-2 30.18%HCPS-3 3.93%。通过傅里叶变换-红外光谱法，液相色谱方法和气相色谱法对进行结构研究，表明：三角帆蚌DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100购自于Sigma化学公司，其他化学试剂均为分析纯。 2.2 多糖的提取 HCPS是依照前人研究报道的方法基础上稍作改良进行提取的。即，收集新鲜的三角帆蚌 Y为响应变量，A0、Ai, Aii, Aij分别是截距、线性二次方程的系数， Xi, Xj分别是独立的变量（i=/j）。通过Design-export软件进行非线性回归分析，从每一组的实验设计中获得的二次多项式系数和响应受非线性回归倍数的影响。多项式方程的失拟度用R2表示，它的统计显著性用F-检验的P值0.001,0.01,0.05检验。回归系数的显著性也用F-检验。 2.4 多糖的纯化 粗HCPS分别用DEAE-cellulose 52 和 a column of SephadexG-100进行纯化，其方法是在Bendahou等的方法基础上稍作修改。粗HCPS溶液（15mg/ml,3ml）注于DEAE-cellulose 52柱（2.6*30cm），然后，用0.0，.,0,0.3,0.5,0.7mol的氯化钠溶液在流速为60ml/h的条件下进行梯度洗脱，自动收集洗脱液（10ml/管）然后用苯酚硫酸法检测多糖的含量。结果获得三种多糖组分，浓缩，透析，进一步通过Sephadex G-100柱进行纯化，获得HCPS-1, HCPS-2 和HCPS-3HCPS-1, HCPS-2 和HCPS-3HCPS成分包含碳水化合物、蛋白质、糖醛酸和硫酸盐。在10mg/ml,25℃条件下用乌氏粘度计测量HCPS的粘度系数（相对于去离子水）, 采用气相色谱法(GC-6890N安捷伦)对HCPS的单糖组分进行分析,用火焰离子化检测器和HP-5毛细管柱(30米0.32 mm 0.25 lm)进行检测。气相色谱的操作条件如下: N2,H2和空气流速分别为25、30和400ml/min,温度、检测器、烘箱的入口温度分别是210,280和250℃。HCPS的相对分子量采用装备有一个TSK-GelG3000SWXL柱高效液相色谱仪测定(1100系列高效液相色谱，安捷伦)，用0.1 molNa2SO4和流速为0.8ml/min，在25℃的条件下进行洗脱，利用标准葡聚糖样品建立标准曲线以此来对样品进行测定。 3 结果与讨论 3.1 提取温度对HCPS得率的影响 研究提取温度对HCPS得率的影响,采用不同的（60、70、80、90 ℃）提取温度（60、70、80、90 ℃）提取HCPS,而其他的提取参数符合如下要求:提取时间4h,料液比1:20，,提取次数为3次。如图1A所示, 从60到90 ℃HCPS得率有一个递增趋势。这个趋势与其他多糖提取报道相符。统计分析表明,显著性差异在60℃，70℃和80℃之间以及在60℃,70℃和90℃(P 0.05),但非显著性差异是80和90℃之间（P0.05）。这些结果表明,正面且显著之影响的萃取温度是当产量小于80 HCPS C,效果并不显著当萃取温度高于80℃。因此,80℃被选定为中心的点萃取温度实验和较高的温度会增加的能源浪费成本为提取工艺。 表1 Box-Behnken设计矩阵和反应收率的HCPS值。 3.2 提取时间对HCPS收率的影响 萃取时间是另一个因素,与流动相影响了提取效率。它已经广泛用于多糖的生产提取。另外,过长的萃取时间会引起多糖的分子结构的变化。 在目前的研究中,提取时间上影响HCPS收率已采用了不同的提取时间(2、3、4和5小时),而其他提取变量如下:提取温度80℃，料液比为20和提取3次。结果表明在随HCPS产量的增加而提高提取时间范围为2 - 4小时(图1 - 1B)。统计分析表明, 在2h、3h 、4h和2h、3h、5h (P 0.05)之间都存在显著性差异,而4h和5h(P 0.05) 其间差异不显著。 因此,萃取时间的4 - 5个小时有利于生产HCPS。为节约能源和降低成本,4小时被选定为最佳提取时间。 3.3