第五节：原生质体培养.ppt

CHAPTER 5 植物原生质体培养和细胞杂交 第一节 植物原生质体培养 第二节 细胞融合（细胞杂交） 第三节 以原生质体做受体的遗传转化 第一节 植物原生质体培养 原生质体的概念： 植物细胞原生质体（protoplast）一词始于Hanstein（1880），在植物学上它是指植物细胞通过质壁分离后可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。 原生质体培养的应用： 1 植物育种 2 打破有性杂交的局限（自由杂交局限、减数分裂局限、胞质基因局限）进行育种 3 遗传转化 4 避免细胞壁上核酸酶对外源基因的破坏 5 利用原生质体瞬间表达系统 6 理论研究 细胞起源、细胞壁再生、质膜结构和功能、核质关系、胞间作用、激素作用机理等。 一?? 植物原生质体研究历史与现状 1、机械法分离原生质体时期 1892年由Klercker用于从质壁分离的Stratiotes aloides 细胞分离原生质体；随后为Chambers和Hofler（1931）将洋葱表皮组织的薄片浸在1.0mol/L 蔗糖溶液中，当原生质体收缩脱离壁时用快的刀片切开表皮细胞，获得了少量表皮细胞的原生质体。 2、酶法制备原生质体阶段 1960年英国Nottingham大学植物学系Cocking首次用纤维素酶从番茄幼苗的根分离得到原生质体，从此开创了用酶法分离植物原生质体的时期。其后纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的商品化，使得实验室制备原生质体成为一中常规技术。 二、植物原生质体研究进展 1、分离方法的改进：商品酶的出现，从各类植物以及不同的器官、组织，都成功地分离到原生质体。 2、原生质体培养技术日趋成熟： 培养基、培养技术的改进极大地提高了培养的效率。现在常用的琼脂糖包埋培养（包括琼脂糖块周围加液体培养基的方法）、液体浅层培养、使用条件培养基或饲喂培养等技术，以及发展出来的一些专门实用于原生质体培养的培养基如KM8p、V—KM、D2a等的广泛使用，均极大改善了培养效率。 3、性细胞原生质体研究： 花粉原生质体、精子和生殖细胞、胚囊及其组成细胞分离成功；单个原生质体培养成功，使人们可以尝试在离体条件下对这些细胞进行操作，发展了雌雄配子的融合技术；培养小麦和大麦的受精卵形成的原生质体发育形成完整植株；利用花粉四分体原生质体与体细胞原生质体融合获得三倍体杂种植株等。 4、原生质体遗传操作： 利用原生质体导入外源DNA获得转化植物，在多种植物中获得成功，已由大豆、杠豆、柑橘、多种芸薹属植物、水稻、高粱、玉米、小麦等作物获得转基因植物；建立起有效的叶绿体转化试验系统；植物病毒在原生质体中增殖系统等。 三、植物原生质体的分离和培养 一）、 原生质体的分离 机械法 酶法 影响原生质体分离质量因素： 酶的种类及其组合、酶液的渗透压、原生质膜的稳定剂、酶解时间与温度、分离与纯化的方法等。 1、材料的选择： 要获得产量高，质量好且容易分裂的原生质体，就要注意用于制备原生质体的起始材料的特性和生理状态。 茄科植物一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼嫩叶片分离原生质体。 十字花科植物，一般认为是从种子萌发4～5天的无菌苗下胚轴分离原生质体，得率高、活力强、再生频率高。 豆科用未成熟种子胚的子叶较好。对禾本科植物，从幼胚、幼穗、花药或成熟胚建立胚性愈伤组织及其胚性悬浮细胞系分离原生质体有利于其后的再生。 2、酶制剂： 植物的细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质构成。一般而言，纤维素约占细胞壁干重的25%～50%不等。半纤维素约占细胞壁干重的53%左右，果胶质一般约占细胞壁的5%左右。 双子叶植物的叶片，需用纤维素酶和少量果胶酶 愈伤组织细胞及其悬浮细胞除用纤维素酶外，还需用较多的果胶酶，有些材料还需加入半纤维素酶。 花粉小孢子壁除含有纤维素、果胶质外，还有胼胝质，分解时需用蜗牛酶或胼胝质酶。 3、渗透压的稳定剂： 酶液、洗液和培养液中渗透压应和原生质体内的相同或接近，渗透压略大些有利于原生质体的稳定，过大会使原生质体收缩并阻碍原生质体的启动分裂。 广泛使用的渗透压调节剂使甘露醇和山梨醇、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖，其浓度约在0.4～0.6mol/L。 加入CaCl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾都可以提高原生质膜的稳定性，增加完整的原生质体数目和活力。葡聚糖硫酸钾