大肠杆菌病实验 禽类实验室诊断技术课件.ppt

鸡大肠杆菌病实验室诊断 一、实训目的 掌握鸡大肠杆菌的分离鉴定方法 二、实训器材 疑似大肠杆菌病鸡、营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、 SS琼脂平板、远藤氏琼脂平板、肉汤培养基、糖发酵培养基、接种环、酒精灯、剪刀、镊子、载玻片、显微镜、恒温培养箱等。 三、实训方法 1、病料的采集 无菌采急性败血症死亡鸡的心血和肝脏，亚急性纤维蛋白病变的心包和气囊，脓性病变关节的渗出物或脓液，输卵管炎和腹膜炎的干酪样物等病料 。 2、涂片镜检 用接种环以无菌操作的方法抹片或用肝脏、心脏直接触片，干燥、火焰固定，革兰氏染色、镜检可见两端钝圆，成对或单个存在的阴性短杆菌，无芽孢、无荚膜。 红色： G-；蓝色： G+ 3、分离培养 无菌采集的病料分别划线接种于麦康凯琼脂平板上，37℃培养24h，观察菌落特征。 选取麦康凯琼脂平板上桃红色、边缘整齐的单个菌落的小部分革兰氏染色、镜检,见到呈成对或单个存在的革兰氏阴性短杆菌。 菌落的其余部分再分别接种于营养肉汤培养基、普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、 SS琼脂平板及远藤氏琼脂平板上，置37℃温箱内培养24h，获得分离菌的纯培养物及在不同培养基上的生长情况。 大肠杆菌培养特征 液体肉汤培养基中生长特征：均匀浑浊生长，24h后可形成菌膜，管底有黏液状沉淀物。 营养琼脂平板上生长特征：菌落较大直径1.5~2mm，形态凸起，光滑湿润，灰白色，半透明，边缘整齐，并带有特殊的粪便样臭味。 麦康凯琼脂平板上生长特征：菌落呈鲜桃红色，边缘整齐，稍凸起，表面光滑湿润，直径1.5~2mm。 伊红美蓝琼脂平板上生长特征：菌落圆形，表面光滑，边缘整齐，呈紫黑色带金属光泽。 SS琼脂平板上生长特征：菌落呈红色，但其周围色稍淡。 远藤氏琼脂平板上生长特征：菌落呈紫红色带金属光泽。 挑取可疑菌落涂片、革兰氏染色镜检，见两端钝圆、革兰氏阴性小杆菌、无芽孢、无荚膜。另外，挑选可疑菌落作纯培养进一步鉴定。 营养琼脂平板上生长特征 麦康凯琼脂平板上生长特征 伊红美蓝琼脂平板上生长特征 4、 生化实验 从麦康凯培养基上，挑取单个可疑菌落分别接种于各种生化培养基，37℃培养24～48小时后，观察其生化反应特性。 大肠杆菌生化特征 大肠杆菌能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等产酸产气。大多数菌株能发酵乳糖，只有个别菌株发酵迟缓。各菌株对蔗糖的发酵不一致。 能产生靛基质，不形成硫化氢。 MR反应阳性，VP反应阴性，不分解尿酸，不能利用枸橼酸盐等 。 5. 致病性试验（动物试验） 用来判断分离出来的大肠杆菌是致病性的，还是非致病性的。 方法： （1）用大肠杆菌24h的肉汤纯培养物，给3--5日龄的雏鸡腹腔注射，0.2~0.3ml/只。设立阴性对照组（腹腔注射，0.2~0.3ml/只生理盐水）。（2）取死亡雏鸡的组织、触片、染色、镜检及划线接种，应分离到与接种菌完全一致的病原菌。 6、血清学鉴定 目前已知大肠杆菌具有173种O抗原（菌体抗原）、80种K抗原（荚膜抗原）、56种H抗原（鞭毛抗原）和17种F抗原（菌毛抗原）。 在禽大肠杆菌病实验室诊断中一般只需做O抗原鉴定。 玻片凝集反应操作： 将营养琼脂斜面培养物用1ml0.5%石炭酸生理盐水冲洗，制成浓缩菌悬液，121.3℃高压处理2h，破坏其K抗原，冷却后取菌悬液与单价抗O血清各一滴置于洁净的玻板上混匀，l~2min内出现明显凝集颗粒者为阳性反应。同时以菌悬液与0.5％石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象。如果与某个单因子血清发生凝集时，该因子血清的抗原即为该菌的血清型。 * * 大肠杆菌 糖发酵实验阴性 糖发酵实验产酸产气 *