2885.B根癌农杆菌介导25A合成酶基因对本氏烟的遗传转化的研究.pptVIP

2.2无菌苗的获得 将本氏烟种子在无菌条件下，使用70％乙醇浸泡30s，升汞溶液消毒2min，无菌水冲洗5次，稍风干后均匀点播于1/2 MS固体培养基上，25℃暗培养3天后，于25℃光照强度6000lux及光照时间16h/d条件下培养。6周后获得叶盘为2-3cm的所需烟草无菌苗（见图二）。 图二：经无菌操作得到的烟草无菌苗 2.3 根癌农杆菌介导的烟草叶片的遗传转化及转基因植株的再生 将在三角瓶内生长六周左右的无菌苗，将其叶片切成小叶盘，浸入摇好的含有植物表达载体PBINplusA的土壤农杆菌LBA4404菌液中，10～15min后取出叶片，用滤纸吸干多余菌液，共有111片外植体，转入共培养基MS＋1 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IAA (pH7.0)上暗培养48h。 然后转入含有50mg/L Kan +400 mg/L Ce (pH5.8)的分化培养基上（Ce抑菌，Kan筛选抗性再生植株），诱导愈伤组织产生，每15d换一次培养基，对于中途污染褐变的外植体要立即取出，在无菌条件下将同一培养皿中未污染的转移到另一新培养皿。 在分化培养基上培养15d左右，产生了愈伤组织，以后愈伤组织逐渐变绿，20d后从愈伤组织上分化出不定芽；30天后有57个外植体诱导产生出了愈伤组织，其中有30个分化出了不定芽（见表一，图三）。 表一：外植体愈伤分化情况 天数 外植体数(个) 愈伤组织的诱导率% 不定芽分化率% 15 111 30.0 0 30 111 51.11 52.9 注：愈伤组织的诱导率%=愈伤组织的诱导数/外植体数。 不定芽分化率%=不定芽分化数/愈伤组织的诱导数。 a b c 图三：由叶盘转化法得到的烟草叶片愈伤组织 及分化出的不定芽 （a:15天后诱导出现愈伤组织；b:20天后愈伤组织继续分化；c:30天后分化出的不定芽） 由表一可以看出，我们获得了有抗性的愈伤组织，并在筛选培养基上分化出了不定芽； 图三表明，可能目标基因已经转化，还需进一步进行检测验证是否就是转基因烟草。 3讨论 3.1叶片的取材 叶片取材相当容易，但是转化要选用健壮而较幼嫩的叶片（长至2-3cm为宜），若叶片太嫩，则在农杆菌侵染后叶片就会脱水；若叶片太老，农杆菌侵染后叶片就会失去活力。在接种叶片时，要把叶片的正面贴在培养基上，因为这样观察到这样放置的再生效果较好。 3.2影响农杆菌转化的因素 转化体的选择是遗传转化过程中一个重要步骤，一般采用适当的选择剂进行筛选，被转化的细胞能在含有选择剂的培养基上生长和分化，而未被转化的细胞则被抑制和杀死。一定要选用合适的选择剂浓度，选择能全部抑制或杀死外植体的最小(临界)浓度作为选择剂的最适浓度。 在农杆菌转化植物细胞时,本实验采用头孢霉素抑制农杆菌生长,卡那霉素用以筛选。对于卡那霉素所选的作用浓度为50ug/ml，如果其浓度过小，在筛选抗性植株时就会出现较多的假阳性植株；如果浓度过大，就会抑制转基因植株的再生。 选用头孢霉素的作用浓度为400ug/ml,它可以抑制根癌农杆菌的过度繁殖，因此浓度也要适量。然而，对于烟草来说，由于影响转化效果的因素还很多，例如，植物的基因型、农杆菌菌株以及农杆菌与外植体共培养的条件等。 在农杆菌介导的遗传转化过程中，农杆菌作为一个独立体系直接影响到转化频率的高低。在农杆菌快速的生长过程中常常会出现质粒丢失、基因突变。因此，不但要选择培养基上进行划线培养获得单一菌落。取单一菌落进行悬浮培养，在合适的时机与植物细胞或组织混合共培养，其余的菌落可在固体平板培养基上于4℃下保存数月或15%甘油中-70℃长期保存。利用对数生长期的农杆菌进行保存、筛选、繁殖和转化最为有效。 农杆菌的浓度也会影响转化效率，在对农杆菌的稀释过程中发现，农杆菌浓度过高，会对叶片造成污染，致使叶片死亡，而浓度过低，农杆菌进入植物体的数目减少，转化的成功率会降低。 温度与转速同样也会影响转化效率，若温度过高，可能会引起质粒丢失，而温度过低，农杆菌生长缓慢。同样转速低于250r/min，农杆菌生长到对数生长期时间就长。 农杆菌叶盘直接浸泡法进行外源基因转化时,感染后共培养时间的长短会影响转化效率，如果太短，外源DNA还来不及整合到植物DNA中，而时间过长，根癌农杆菌过度生长，又会损坏植物细胞造成再生困难。不同的烟草品种在整个转基因的过程中所需的时间不一样，这与不同的烟草品种的生长周期有关。 通常共培养时间为2d.而在实验中发现不能完全依赖天数来确定培养的最佳时间.菌液浓度、温度、植物