Bt水稻辐照处理后的生理生化指标变化的研究.docVIP

PAGE PAGE 8 Bt水稻辐照处理后的生理生化指标变化研究 陈小坚 顾勤琴 陈玉玲 水稻是我国的第一大粮食作物。一直以来，我国水稻生产都面临着巨大困扰：虽然20世纪50年代末和60年代初的矮化育种技术使得品种的耐肥、抗倒性和收获指数大幅度提高，但是水稻病虫害[1]的发生程度却变得更加严重。虽然我国经过长期努力，利用传统技术在提高水稻的抗性方面取得了一些成功，但水稻病虫害仍未得到有效控制，水稻生产中农药使用量[2]在不断增加，会对生态环境和食物链造成破坏，事实表明，利用传统技术在控制病虫害方面难以有大的突破。然而，20世纪80年代兴起的现代生物技术可能为水稻及其他农作物生产状况的改善带来新的希望。利用现代生物技术，许多农作物的一些重要生产性状，如抗病、抗虫、抗逆、产量、品质及采后保鲜等都得到了明显改善，大大提高了现代农业的技术含量和技术附加值（科技部，2002）。利用转基因技术[3]培育抗病、抗虫水稻[4]新品种成为解决水稻病虫害、减少农药使用量的重要手段之一。Bt基因是一种革兰氏阳性芽抱细菌苏云菌杆菌（Bacillus thuringiertsis Bt）杀虫晶体蛋白基因的简称。由于这些晶体蛋白具有杀虫活性，故被称为“杀虫晶体蛋白（Jnsecticidal crystal proteins,ICPs”或“s—内毒素(8-endotoxin）”。其杀虫机理为，由于螟虫的肠内环境是碱性的，与Bt基因作用后会产生原毒素，而产生毒杀作用。 为了检测辐射对Bt转基因水稻和对照在种子萌发以及幼苗中一些生化物质含量是否有差异，本试验选择了淀粉酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、叶绿素含量和根系活力这八个重要的生理指标。其中淀粉酶[5]是水稻萌发过程中最主要的水解酶类，水稻种子萌发过程中，淀粉酶活性与胚乳消耗速率成正相关，盾片上皮细胞或糊粉层产生的淀粉酶运入胚乳，胚乳中的碳水化合物在淀粉酶的作用下转化为糖，然后再运往胚的生长部位，为胚提供形成新组织的材料和发芽能量。种子的高萌发势和快速萌发能确保种子在适宜条件下尽快发芽，开始自营生活，减少育秧过程中种子腐烂和幼苗死亡。　过氧化氢酶[6]又称触酶（CAT），是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的酶。过氧化氢酶是生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一。其生物学功能是催化细胞内过氧化氢的分解防止过氧化。过氧化物酶（POD）是是清除过氧化氢的重要保护酶，从而使机体免受过氧化氢的毒害作用。超氧化物歧化酶[7]（SOD）普遍存在于生物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，具有保护生物体免受活性氧伤害的能力。多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生琨。苯丙氨酸解氨酶[8]（PAL）催化L-苯丙氨酸的脱氨反应，释放氨而形成反式肉桂酸，该酶在植物的次生物质的代谢中起重要作用，与植物的抗病作用有一定关系。水稻根系主要由不定根组成，是吸收养分和水分的主要器官，并进行一系列有机化合物的合成反应，对地上部的形态形成及新陈代谢过程起着极其重要的作用。 本试验在种子萌发阶段时，测定对照和辐射处理的转基因水稻的淀粉酶活性，以及在后期幼苗阶段测定CAT、POD、PPO、PAL、叶绿素含量以及根系活力的差异，以明确辐射处理对Bt转基因水稻生理生化特性的影响，为下一步新型抗虫水稻的诱变选育提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 本试验所用材料分别为Bt转基因抗虫水稻TS9和非转基因水稻TS2[9]，其中部分TS9经200Gy的辐射处理。每个水稻品种或处理选取50粒饱满、健康的种子。 1.2 浸种催芽与培养 种子处理：分别选取健康的辐射处理Bt转基因水稻TS9，以及对照样品CK、TS2水稻种子各50颗。种子充分吸胀后催芽,置于25 ℃培养箱内培养。3d取部分种子用于测定淀粉酶活性。 将已发芽的种子转移到土壤中培养，在室温下每天定期加水以保持水分。待其幼苗长到一定程度后，剪下叶片，并放入冰箱内冷冻保存。 1.3过氧化氢酶活性 过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。 酶液提取：取水稻叶片0.25g加入pH7.0的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆，转移至量筒中；用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转入量筒并定容至8mL；15000r/min离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 活性测定：在3mL反应体系中，包括0.3%H2O21mL，H2O1.95mL,最后加入0.05mL酶液，启动反应，测定240nm处的OD值减低速度。将每分钟OD的减少定义为一个酶活力单位。 1.4 过氧化物酶活性 在H2O2存在条