- 1、本文档共12页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
分子生物学实验的讲义
PAGE 2
分子生物学实验讲义
中南民族大学生命科学学院
实验教学中心
2006年2月
目 录
实验一 植物基因组DNA的提取
实验二 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增
及琼脂糖凝胶电泳检测
实验三 植物总RNA的提取
实验四 蛋白质印迹
实验一 植物基因组DNA的提取
一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。
三、实验材料
水稻幼叶
四、主要试剂配方
2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M
EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇
(400ul)
氯仿-异戊醇(24:1):先加96ml氯仿,再加4ml异戊醇,摇匀即可。
五、实验步骤
1. DNA的提取
(1) 2%CTAB抽提缓冲液在65℃
(2)取少量叶片(约1g)置于研钵中,用液氮磨至粉状;
(3) 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液,轻轻搅动;
(4) 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中,磨碎液的高度约占管的三分之二;
(5)置于65℃
(6)冷却2 min后,加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管,剧烈振荡2~3 min,使两者混合均匀;
(7)放入离心机中10 000 rpm离心10 min,与此同时,将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中;
(8) 10 000 rpm离心1 min后,移液器轻轻地吸取上清夜,转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动30 sec,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物;
(9)10000 rpm离心1 min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出,将离心管倒立于铺开的纸巾上;
(10)60 sec后,直立离心管,加入720 μl的75%乙醇及80 μl 5 M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中;
(11)放置30 min,使DNA块状物的不纯物溶解;
(12)10000 rpm离心1 min后,倒掉液体,再加入800 μl 75%的乙醇,将DNA再洗 30 min;
(13)10000 rpm离心30 sec后,立即倒掉液体,将离心管倒立于铺开的纸巾上;数分钟后,直立离心管,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干);
(14)加入50 μl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液,使DNA溶解,置于37℃
(15)置于-20℃
2. DNA质量检测
琼脂糖电泳检测,原理和方法见实验二。
六、 注意事项
(1)叶片磨得越细越好。
(2)移液器的使用。
(3)由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。
思考题:
1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么?
CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA
2.提取基因组DNA的方法有哪些?各有何优缺点?
实验二 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增
及琼脂糖凝胶电泳检测
一、 实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理,掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、 实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下:
PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1. 变
您可能关注的文档
- 农校综合楼的方案的设计说明.doc
- 冲压复习题的答案.doc
- 冲压工艺及模具课程的设计课件.ppt
- 冰蓄冷中央空调系统的讲义.ppt
- 冲压模具的设计系统.ppt
- 冲孔孔灌注桩施工的方案.doc
- 冲孔折弯件级进模—毕业的设计.doc
- 冲压件模具的设计.doc
- 冲压课程的设计说明书2.doc
- 冲沙渠施工工的方案.doc
- 《中国通史》文字稿第12集春秋争霸.docx
- java教程--类与对象-讲义课件(演讲稿).ppt
- Vue应用程序开发-(1).pptx
- 东北师大版社劳动实践与评价指导手册一年级上册主题二活动一寻找五彩的树叶课时课件.pptx
- 外研版英语四年级上册 Module 4 Unit 2 How much is it单元教学设计.docx
- 外研版英语四年级上册Module 4 单元整体教学设计.docx
- 6《上课之前》课件 鄂科技版 心理健康教育一年级.pptx
- 《1~5的认识》说课课件(共25张PPT)人教版一年级上册数学.pptx
- 六《解决问题(1)》说课课件 人教版 三年级上册数学.pptx
- 七《解决问题》说课课件 人教版 二年级上册数学.pptx
文档评论(0)