实验动物的组织处理.docVIP

肝脏好比人体化工厂，人体各种营养物质的转化合成都由肝脏完成，各种各样的毒素亦要经过肝脏来排解。少量喝酒，经过肝脏解毒代谢后，变成无毒的物质排出体外;若长期大量饮酒，酒精的代谢产物乙醛对肝细胞的毒性作用就非常大。在多数情况下，人们并不知道自己患上了酒精性法病，等到出现症状以后，如肝区疼痛、全身无力、消化不良、食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻等症状，到医院检查发现肝功能异常，如转氨酶升高，这已是酒精性肝炎。此时若不及时治疗或继续喝酒，很容易发展成为酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，继而还会出现腹水、消化道大出血等，重者有生命危险。酒精肝症状表现：轻症会出现腹胀、乏力、肝区不适、厌食，还有黄疸、肝肿大和压痛、面色灰暗、腹水、浮肿、蜘蛛痣、发热、白细胞增多（主要因此是中性粒细胞增多）类似细菌性感染，少数有脾脏肿大等症状，血清胆红素＜100μmol／Ｌ；中重度除上述症状外，有持续低热、腹泻、四肢麻木、手颤、性功能减退、男性有勃起功能障碍等，肝功能检查有AST和ALT中度升高、AST/ALT比值接近3等指标。酒精肝病理变化：从整体酒精性肝病的发病而言，酒精肝只是酒精性肝病早期出现的一种疾病，或者说属于酒精性肝病的一个病理阶段，若继续发展会发生肝细胞的炎症，以及肝脏纤维化，肝细胞坏死等病理变化。这主要与酒精（乙醇和乙醛）对肝脏的直接毒理作用，以及伴有的营养不良等因素有关。乙醛（高活性化合物）干扰肝细胞功能，损害微管，使蛋白、脂肪排泌障碍而在肝细胞内蓄积，乙醇、乙醛被氧化时，产生还原型辅酶，阻碍肝脏释放蛋白质，抑制糖原异生作用，阻碍维生素的利用，促使和导致脂肪肝的形成；乙醇可阻碍硫胺等向活性型转变或阻碍其利用，最终加速导致肝细胞的脂肪浸润、炎症、坏死。而且酒精引起的高乳酸血症，通过刺激脯氨酸羟化酶的活性和抑制脯氨酸的氧化，可使脯氨酸增加，从而使肝内胶原形成增加，一些炎性细胞因子和乙醇、乙醛的毒性作用可使肝星状细胞、肝细胞、枯否细胞活化，分泌一些细胞外基质，加速和促使肝硬化取组织块 g，置于组织匀浆器中，加入冰浴冷却的生理盐水mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）5 mL研磨成％的组织匀浆液，迅速放入冷冻离心机，r/min 离心15 min，取上清液，冷冻后待用冷冻。 蛋白质含量的测定采用Bradford测定法 。该方法基于考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质－考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，在595 nm处有最大吸收值。蛋白质考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。(1) 蛋白质标准溶液 精确称取100mg牛血清白蛋白即为1000μg/mL牛血清白蛋白液。 (2) 考马斯亮蓝G250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL 90乙醇溶液中，加入85的磷酸100mL，用定容至1000mL。 0-1000μg/mL标准曲线的制作 ① 取6支试管按表配制。准确吸取所配制各管溶液0.mL，分别放入10mL具塞试管中加入mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂盖塞将试管中溶液纵向倒转混合放置2min用光径10mm的比色杯在595nm下比色，以OD595nm为纵坐标，牛血清蛋白浓度为坐标标准曲线。表 蛋白质标准曲线配制试管编号 试剂(mL) 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白溶液1000μg/mL) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 双蒸水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 OD595nm 0.000 0.228 0.375 0.502 0.704 0.845 图1蛋白质的标准曲线 (2) 样品溶液蛋白含量测定（要稀释，50%的组织液要稀释50倍） 吸取0.05mL放入具塞试管中，加入mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用光径10mm的比色杯在595nm下比色(μg/mL)，通过进一步的计算即可得出样品溶液蛋白质总含量(mg)。 样品溶液中蛋白含量(mg)= 1×OD595nm (mg/mL)×样品溶液体积(mL)×稀释倍数 1000 α-酮戊二酸组成的基质，在一定的反应条件下，产生一定量的丙酮酸。在酶反应到规定时间时，加入2,4-二硝基苯肼，在当量浓度的酸性条件下，终止了酶反应。2,4-二硝基苯肼分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质α-酮戊二酸形成各自对应的2,4-二硝基苯腙。在碱性条件下，虽然二种苯腙分别显出红棕色，但由于丙酮酸生成的颜色较深，以同等克分子计算，在480-530nm波长范围内其浓度约为α-酮戊二酸生成的颜色的3倍，利用这一差别可以反映出丙酮酸的生成量。本实验设ALT活力为：样品液与ALT基质液在37℃下反应60min时每生成1μmol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位（U）。 3.2试剂配制 （1） 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）：称NaH2