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米格列奈对内皮细胞一氧化氮合成及氧化应激影响 　　[摘要] 目的 观察口服降糖药米格列奈对高糖环境下内皮细胞一氧化氮（NO）合成及氧化应激反应的影响。 方法 成功培养及传代人主动脉内皮细胞（HAECs），分为对照组（葡萄糖浓度为5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖浓度为30 mmol/L）、米格列奈组（30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L米格列奈）。ELISA法测NO、上清液中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的含量；比色法分别检测6、12、24、48、72 h上清中超氧化物岐化酶（SOD）的活力及丙二醛（MDA）的含量。 结果 ①米格列奈组24 h NO含量为（232.71±8.78）μmol/L，较高糖组低（P 　　[关键词] 米格列奈；人主动脉内皮细胞；一氧化氮；一氧化氮合酶；高血糖；氧化应激 　　[中图分类号] R977.15 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0004-03 　　米格列奈于1992年由Sato等首次合成，是继瑞格列奈和那格列奈后的第3个新型苯甲酸衍生物类降糖药[1]。其不仅具有速效、强效、短效降糖的特点，同时还有改善胰岛素抵抗、抗炎及抗氧化应激等作用[2-3]。有研究表明，糖尿病慢性并发症的发生与血管内皮功能紊乱关系密切[4]。本研究通过观察米格列奈对高糖环境下内皮细胞一氧化氮（NO）合成及氧化应激的影响，从而进一步探讨米格列奈对高糖环境下人主动脉内皮细胞（HAEC）活性的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　HAEC及内皮细胞培养基购自于美国ScienCell研究实验室（ScienCell 6100）。胎牛血清购自于杭州四季青生物工程材料研究所。人NO、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）ELISA检测试剂盒购自于美国R and D公司。超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测试盒购自于南京建成生物工程研究所。 　　1.2 方法 　　1.2.1 分组 分为对照组（葡萄糖浓度为5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖浓度为30 mmol/L）、米格列奈组（30 mmol/L葡萄糖浓度+10 μmol/L米格列奈）。 　　1.2.2 细胞培养 HAEC在含10%胎牛血清的培养瓶中常规培养，条件为：5% CO2 37 ℃。在HAECs达80%左右融合时用含2%马血清的DMEM培养液诱导分化成为成熟HAEC。 　　1.2.3 一氧化氮及一氧化氮合酶测定 按说明书制成浓度分为12.5、25、50??100、200 μmol/L的标准品稀释液，分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔加入稀释好的标准液50 μL；在酶标包被板上待测样品孔内先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30 min。弃液甩干后每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。轻轻晃动摇匀，37℃温育30 min。再次弃液甩干，加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10 min。取出酶标板，每孔加终止液50 μL，终止反应。以空白孔调零，在450 nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。根据标准曲线计算出对应样品浓度。 　　1.2.4 超氧化物歧化酶的检测 取细胞培养液，3500 r/min离心10 min，取上清0.1 mL待测。按照说明书要求加入0.1 mL试剂1摇动几下试管，再加入试剂2、3、4各0.1 mL，混匀，塑料薄膜封口，刺一小孔，37℃水浴40 min，加入显色剂1 mL，混匀，室温放置10 min，于波长550 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值，根据公式计算SOD活力。 　　1.2.5 丙二醛的检测 取培养液，3500 r/min离心10 min，取上清0.05 mL待测。按照说明书要求加入0.05 mL试剂1摇动几下试管，再加入0.75 mL试剂2及0.25 mL试剂3，混匀，塑料薄膜封口，刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷却。再次3500 r/min离心10 min，取上清液，532 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值，根据公式计算上清液中MDA含量。 　　1.3 统计学方法 　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，采用one-way ANOVA进行显著性检验，组间比较采用S-N-K检验，以P 　　2 结果 　　2.1 药物干预HAECs不同时间NO的变化 　　以浓度为5.5 mmol/L及30 mmol/L的葡萄糖、30 mmol/L的葡萄糖+1